Bonjour à tous, svp j'ai besoin de votre aide très urgente, enfaite je suis une doctorante et j'ai sensé de faire des amplifications de cytochrome b sur un espèce de poisson mais j'ai un grand problème du faite que l'ADN que je l'extrais à l'aide d'un kit se dégrade très vite quoi qu'il soit bien conservé
Dernière modification par Flyingbike ; 12/12/2015 à 09h51.
Bonjour,
t'as vérifié ton ADN en le chargeant drectement pure sur gel, directement après extraction, et répété la manip quelques jours après extraction?
fais le deux fois chaque fois (tu perdra environ 4 microlitre mais si tu peux en re-extraire tu devrais pas être a 4microlitres près
Sinon tu stock a combien? dès que tu t'en sers pas c'est à -40°
tu est sur d'avoir bien mis la bonne quantité d'inhibiteur de DNAse dans ton extraction?
tes ratio de purités sont bons? (A260/A280 et A260/A230)
il nous faudrait un peu plus de details si tu veux de l'aide
Merci bien Loupsio pour votre aide,
ouii je vérifie la qualité de mon ADN directement après chaque extraction et les ratio de puretés sont bons autour de 1.8 mais enfaîte je conserve mes ADN dans un simple congélateur à -4 ° et même je ne met pas des inhibiteurs d'ADNase puisque j'utilise un kit d'extraction et pas un protocole de CTAB dont je peux mettre le Mg + EDTA.
Utiliser des kits ne vezut pas dire qu'il ne faut pas utiliser des inhibiteurs,
La protéinase K est la plus utilisée, même dans les kits (après peu etre pas tous, certains on deja peut etre l'inhibiteur dans l'un des buffers, mais ce n'est pas une chose certaine) le tampon de lyse sert a detruire les membranes, et le bonding bufer sert a lier a la colonne, verifie si il y à bien un inhibiteur type protéinase K sinon je te conseille de rajouter juste après avoir mis ton tampon de lyse et avoir agité un peu. Surtout si en plus tu observe une dégradation de ton ADN récurrente.
Si c'est sur du court terme, -4° est suffisant, surtout si tu l'utilise assez souvent, ca évite les cycles de congel décongel, c'est pas ca qui devrait etre la cause, le tout est de bien mettre a -20 ou -40 pour le stockage longue durée
c'est pas mes premières manip j'ai effectué des extractions avec d'autres espéces et j'utilise bien évidament la protéinase k et le -4 degré pour une conservation à courte terme et j'ai pas eu ce type de problème et cette dégradation assez rapide d'ADN
pas évident a deviner puisque tu disais :j'utilise bien évidament la protéinase kla protéinase K est un inhibiteur.je ne met pas des inhibiteurs d'ADNase puisque j'utilise un kit d'extraction
mais si ce n'est pas ca, alors essai de passer à un protocole genre trizol ou CTAB voir si tu as le même résultat, peut être que ton kit est optimal pour certains tissus mais pas sur le poisson, si tes extractons précédentes étaient sur un autre type tissulaire
Et c'est des trucs tout con auxquels on pense pas, et surtout on pense pas que ca peut arriver, mais vérifie que ton frigo est bien 4°, des frigos qui lachent ca arrive, et ca peut prendre parfois un peu de temps avant que quelqu'un s'en aperçoive, j'ai déjà vu ça.
Sinon a part tester un autre protocole, si le frigo est Ok, que l'echantillon reste bien sur glace aussi souvent que possible et qu'il y a bien des inhibiteurs, et que tu n'as rien changé dans tes habitudes de manipulation... il n'y a pas beaucoup d'autres solutions,
si tu as moyen, tente un autre kit que celui que tu utilise, sinon utilise le trizol ou CTAB
Bonjour,
Qu'est ce qui vous fait dire que l'ADN se dégrade? Car vous n'amplifiez pas votre fragment en PCR? Peut être un problème de PCR, d'amorces, ...
L'oeuf ou la poule en premier? L'oeuf provenant d'une proto-poule bien sûr...
Au bout de quelques jours quand elle charge sur gel elle n'obtiens plus une seule bande comme lorsqu'elle charge juste apres extraction (enfin c'est ce que j'ai cru comprendre de sa réponse quand je lui ai demandé si elle avait chargé sur gel a plusieurs jour d'intervalle)
Bonjour,
Du génomique sur gel ça ne fait pas une seule bande mais un smear de hautes tailles. Après je n'ai pas vu dans ses dires que le profil de migration changeait après quelques jours. J'ai trouvé assez évasive la description de la dégradation.
Dernière modification par vinssss ; 12/12/2015 à 12h34.
L'oeuf ou la poule en premier? L'oeuf provenant d'une proto-poule bien sûr...
Techniquement non pour du génomique si il n'est pas degradé tu obtiens une seule bande (plus ou moins epaisse par rapport à une bande normale) car les chromosomes font plus ou moins la meme taille (apres ca depend des organismes, je ne parle pas du chromosome Y humain comparé aux autres) et et les quelques differences de taille ne se voient pas à de hautes tailles à moins de faire migrer longtemps
Si tu obtiens un Smir a hautes tailles c'est qu'il commence déjà a se degrader mais que les fragments d'ADN clivé sont encore de grande taille et par conséquent encore utilisable en PCR la plupart du temps.
Après je dis ca... j'utilise en routine du végétal, peut être que pour les poissons c'est différents, mais ca m'étonnerai qu'il y ait assez de chromosomes et de taille assez variés en taille dans de grandes proportions pour faire un Smir.
Après, la base je lui demandais si elle avait testé de charger pur directement ET après quelques jours. La réponse globale avait l'air d'être "oui", mais c'est vrai qu'en relisant sa réponse, elle ne mentionne que avoir chargé juste après extraction. Peut être a-t-elle mal compris ma question, auquel cas il serait bon de savoir effectivement si elle avait bien vérifié son profil de migration après quelques jours pour verifier que c'est bien dégradé et que le problème ne vient pas d'ailleurs.
