électrophorèse SDS PAGE

[Zeineb87]

Bonjour,

J'ai besoin de vos avis/conseils:
J'effectue des gels en SDS PAGE en poly-acrylamide 12,5 %.
Je travaille avec des protéines recombinantes. Avant j'avais des bandes extraordinaires et bien claires ms dernièrement la séparation ne se fait pas comme il faut et n'arrive pas au front de migration!!!
Je dépose pr le moment juste le marqueur de poids moléculaire ms j'obtiens que des bandes sérées et très proches et qui restent en haut du gel de séparation!
Je travaille toujours ds les les mêmes conditions opératoires.
Quelles peuvent être les causes?
Vos suggestions SVP!!
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[Tibosax]

Tu utilises bien de l'acrylamide pour protéine et non pas pour acides nucléiques ?
Tu utilises les bon buffers pour tes stackings et runnings gels ?
Tu utilises le bon tampon de migration (TGS) ?
Tu utilises bien du loading buffer pour protéines et non pas pour acides nucléiques ?
Quand tu coules ton running, tu utilises bien de l'isopropanol et pas de l'éthanol pour "lisser" la surface ?
Tu migres à quelle vitesse pour combien de temps ? Tu as essayé de runner plus longtemps ?
Tu branches tes électrodes dans le bon sens ?

[Flyingbike]

90% des problèmes de migration se résoudraient facilement si on apprenait au gens les bases de l'électricité du western

Vous migrez en Volt fixé ? Si oui quel est le courant qui passe (s'il y en a un) ?

Si vous migrez en courant constant, vous êtes à quelle tension ?

[Zeineb87]

Ouiii je fixe le voltage, au début je l'ai fixé à 120V et s'affichait 19 mA, cela pendant 1H 30min
avec ces conditions j'ai obtenu des résultats parfaitement clairs ms dernièrement j'avais un problème au niveau du courant.
J'ai réalisé que c'était un problème de cuve.
J'ai changé de cuve et j'ai lancé la migration ds les mêmes condtions
le voltage tjrs fixé à 120V et s'affiche parfois 30mA parfois 65mA!!
j'ai essayé de prolonger la durée jusqu'à 3h et j'ai essayé aussi de diminuer le voltage à 100V ms tjrs le mm résultat!
pas de séparation !!!

[A voir en vidéo sur Futura]

[Zeineb87]

Tibosax
ouiii c de l'acrylamide pr protéines
ouiii j'utilise les bon buffers pour les stackings et runnings gels
J'utilise le tampon de migration (TGS), "laemmli"
J'utilise le marqueur de poids spécifiques pour protéines
J'utilise de l'isopropanol pour "lisser" la surface ouiii
Je fais la migration à 120 V pendant 1h30, et j'ai essayé de prolonger la durée jusqu'à 3h ms en vain
Je branche les électrodes dans le bon sens

[Zeineb87]

Bonjour Flyingbike,

Je fais la migration en volt fixé. Normalement je le fixe à 120V, parfois le courant reste fixé à 120v et le générateur affiche une tension de 50mA, dans ce cas j'obtiens de bons résultats et j'ai une très bonne séparation. Mais le problème qui se pose c'est que parfois le courant s'arrête à 60V et 70mA et dans ce cas j'obtiens une mauvaise séparation et la migration s'arrête au milieu du gel.
J'arrive pas à comprendre ce qui se passe!!! SVP est ce que vous avez une idée? sachant que j'utilise deux générateurs et les deux affichent ces mêmes valeurs!!!
J'attends vos feedback et merciiii.

[Flyingbike]

Les electrodes sont OK ? le niveau de tampon est suffisant ? le tampon est correctement dilué ? Pas de bulles sous le gel ?

[Zeineb87]

J'ai vérifié les électrodes électriquement et sont OK.
Le tampon est correctement dilué comme c'est mentionné dans protocole et son niveau est suffisant et il y a pas de fuites.
Pour le gel y a pas de bulles d'air à l'intérieur!!!

[Flyingbike]

vérifiez les ph des tris, du tampon de migration, du tampon de charge alors