Bonjour,
j'ai lancé 3 gènes, mais à chaque fois j'aurai que le bruit de fond, alors ces gènes sont normalement bien exprimé dans mon échantillon? j'ai bien vérifie que ma RT est ponctionnée et que les primers utilisés sont bonnes aussi. j'aurai besoin des explication de la part des experts de qPCR? Merci préalablement.
il y a tellement de paramètres.....
il faut tout nous donner : quels sont les échantilons d'origine, quelle quantité a été rétro, par quelle enzyme, quelle dilution, quelle cycle, quelle taille d'amplicon, quelle technologie, etc....
La vie trouve toujours un chemin
je travaille sur les enzyme implique dans le métabolisme de la vitamine D (VDR, Cubiline, Mégailne et CYP3A11) dans le foie. je prépare ma plaque de la façon suivante:
Préparation de mix ( SYBER+ eau ARNase free+ les 2 primer R et F)
je dépose dans chaque puits 2.5 de mon cDNA.
je rajoute 10 µl de mix dans chaque puits.
je centrifuge.
en fin je lance dans Biotecon Stratagene MX3005P.
Merci préalablement
vous avez dosé vos ARN ?
vous les avez déposé sur gel ?
vous avez mis combien dans la RT ?
quel est votre protocole de RT ?....
La vie trouve toujours un chemin
merci beaucoup Flyingbike.
J'ai confirme que la RT est bien marché. parce que j'ai fait le 18S et j'ai eu des bonnes résultats. je voudrais vous demande si il un problème avec le SYBER, comment je pourrais détecter ça?
dans ce cas il n'y a pas trop de raisons pour que le reste ne fonctionne pas sauf si :
les amorces sont foireuses
le gene ne s'exprime pas
le programme n'est pas adapté aux amorces
donnez un exemple de gene et ses amorces que je regarde.
et : qu'est ce qu'il vous fait dire que ca n'a pas marché ?
La vie trouve toujours un chemin
ça n'a pas marché je voudrais dire que il a que bruit de fond, le gène (CYP3A11) est normalement exprimé dans le foie et les amorces ont été utilisé au paravent.
faites voir vos amorces ?
voius n'avez toujours pas dit quelle quantité d'adnc il y avait a la fin dans le mix...
La vie trouve toujours un chemin
Aujourdhuit, on a changé le Syber et on a de l'amplification. j'ai pas bien compris comment ça se fait, mais le syber a un rôle important?
si vous ne répondez pas à mes questions, je pourrais pas vous aider....
Oui c'est important, cela sert a détecter vos amplicons. C'est un intercalant fluorescent...
La vie trouve toujours un chemin
je suis désolé j'ai été au manip,
Protocol RT
1- Calculer le volume d'ARN et H2O nécessaire pour chaque échantillons afin d'obtenir une concentration identique
(généralement 500 ng/uL ou 1ug/uL) cf tableau excel
2- Préparer les ARN à la concentration déterminée (en 1er l'eau), les décongeler sur glace puis vortéxer + speen
3- Préparer le mix commun (nombre de vol = nombre d'ech + 1 ou 2 vol mort)
Réactifs (uL) Pour 1 ech (µl) 32
Tampon 5X 4 128
DTT (à 0,1 M) 2 64
dNTP (à 5mM) 2 64
Hexamer (à 0,3 ug/ul) 1 32
Enzyme = Rtase M-MLV (à 200U/ul) 1 32
Volume TOTAL 10 320
Ne pas vortexer quand il y a l'enzyme
4- Mettre 10 uL de mix/ tube
5- Incuber 1h à 37°C au BM
6- Ajouter 80 µL d'H2O RNAse free / tube
7- Conservation -20°C
PROTOCOL qPCR
qPCR en P96 (SYBR GREEN Eurogentec)
12/03/2014
Gène à tester : 18S
CYP24
1- Calculer le volume de mix commun à preparer (à TA) :
36 nombre ech + 2 NTC (blanc) + 2 volumes morts = Y uL
Réactifs (uL) Pour 1 ech 64
SYBR 2x 6,25 400
H2O 3 192
Amorce_F 0,375 24
Amorce_R 0,375 24
Vol TOTAL/puit 10 640
2- Mettre 10 uL de mix/puit (à TA)
3- Mettre 2,5 uL d’ADNc (à TA)
Sans vouloir faire du plagiat de propos tenus par Flyingbike ... il serait en effet utile que vous nous donniez la séquence des primers que vous utilisez pour l'amplification si vous voulez qu'on avance
as-tu dosé tes acides nucléiques? quels étaient les concentrations après reverse transcription? quels ratios de purité as-tu obtenu? (le 260/280 et 260/230)
