Probleme PCR en temps réel
Bonjour à tous,
Est-ce que quelqu'un pourra m'expliquer pourquoi à chaque fois que je fais mon PCR, la valeur du CT est toujours indéterminée? alors qu'automatiquement le thermocycleur devrait choisir le CT après distinction de la courbe d'amplification caractéristique et le baseline.
Nb: j'utilise un step One applied biosystem
Merci beaucoup,
parce que votre amplification est très faible, parce que votre PCR ne fonctionne pas bien. Et là il y en a des possibilités : programme (durée, température), échantillons (qualité, quantité), amorces.... Il faudra en dire plus !
La vie trouve toujours un chemin
en faite, j'ai fait migrer les produits PCR sur gel d'agarose et les amplicons y sont bien présent. serait-il un problème de sonde par hasard?
ah c'est du taqman ?
Les amplicons sont a la taille attendue ?
La sonde est récente ?
Vous avez bien réglé le programme en fonction de la sonde et du fluo ?
Vous avez le bon mix ?
La vie trouve toujours un chemin
oui, c'est du taqman, et les amplicons correspondent bien à la taille attendue. Effectivement, la sonde est récente. Je voudrai rajouter que le Tm des amorces est 56.2°C pour le sens, 56.9°C pour l'antisens et 67.9°C pour la sonde et j'ai pris 60°C pour la température d'hybridation. Est-ce que celà pourra bien convenir à l'amplification?
c'est quoi votre programme ? et la taille de l'amplicon ? et le mix ?
La vie trouve toujours un chemin
L'amplicon est de l'ordre de 100 pb, et le programme ainsi que la composition du mix sont les suivants:
1s a 72 ? Ça me paraît court
C'est un programme de roche et un mix de roche, ça a déjà été testé sur le AB ?
La vie trouve toujours un chemin
C'est vie un mix probe que vous avez et pas un sybrgreen ?
Dernière modification par Flyingbike ; 31/10/2016 à 14h20.
La vie trouve toujours un chemin
Je n'ai aucune information quant à celà. On m'a juste donné le protocol et nous n'avons que le AB comme appareil. Seulement, j'ai testé le Master mix avec d'autre réactif de AB et le PCR a bien marché? et je suis un peu perdu
