Bonjour à tous,
Je ne comprends pas comment on peut utiliser les plasmides pour produire des protéines pour l'utilisation médicale par exemple l'insuline (on tire profit de l'opéron lactose??) . Comment est-ce qu'on force les bactéries à garder le matériel génétique introduit et comment ça se fait qu'il y a une partie des bactéries qui n'est pas transformé par le plasmide? (qu'est-ce qu'on fait avec cette partie?)
Est-ce que quelqu'un qui comprends mieux peut m'expliquer?
Merci beaucoup
Bonsoir,
On tire profit de l'opéron lactose oui. L'idée est d'introduire un transgène dans E.coli pour faire multiplier E.coli ensuite avec le gène d'intérêt et produire en grande quantité l'insuline. Il faut donc nécessairement un promoteur procaryote pour que E.coli puisse transcrire et traduire l'insuline et qu'on récupère l'insuline dans le milieu de culture.
En réalité l'insuline a 2 chaînes polypeptidiques reliées par des ponts disulfures. En pratique on va mettre 2 transgènes dans E.coli (donc deux constructions plasmidiques différentes), un pour chaque chaîne. Et pas n'importe comment. Déjà les deux plasmides auront un gène de résistance à l'ampicilline, un antibiotique. Cela permet de sélectionner uniquement les bactéries qui auront intégré la construction d'intérêt (et donc les chaines d'insuline).
Les autres vont crever.
La construction plasmidique est la suivante : [promoteur de l'opéron lactose]-[beta-galactosidase]-[AUG]-[chaine A ou B de l'insuline]-[...]-[gène de résistance à l'ampicilline]-[...]
Dans un premier temps E.coli va croître dans un milieu sans lactose et en présence d'ampicilline. Cela permet d'éliminer les bactéries n'ayant pas intégré le plasmide recombinant (et donc le gène de résistance) et d'obtenir les bactéries d'intérêt, sans transcrire la beta-galactosidase et la chaine d'insuline.
Les protéines n'ayant pas intégré le plasmide vont donc crever, on ne fait rien avec. Pourquoi toutes les bactéries n'intègrent pas le plasmide ? Pas vraiment de réponse, ça dépend de beaucoup de choses, c'est un peu comme les transfections pour les cellules eucaryote, tu n'as jamais 100% d'intégration et tu dois valider tes transfections.
Dans un second temps on met du lactose pour transcrire la beta-galactosidase et la chaine A/B de l'insuline associée. Tu as donc une fusion traductionnelle car tu as la beta-galactosidase fusionnée à la chaine A ou B de l'insuline avec un AUG entre les deux, il faut virer le codon stop de la beta galactosidase sinon la traduction va s'arrêter. L'intérêt d'avoir une protéine hybride beta-galactosidase et chaine de l'insuline est d'éviter la dégradation de l'insuline, en effet la bactérie ne connait pas ce gène car elle n'en a pas besoin donc fera tout pour le dégrader. Alors que la beta galactosidase elle le connait bien donc ta chaine d'insuline sera protégée de la dégradation.
Tu remarqueras également la présence de l'AUG entre la beta galactosidase et la chaine d'insuline, c'est une méthionine. On va mettre du bromure de cyanogène qui clive les résidus méthionine, cela va donc séparer la beta galactosidase des chaînes d'insuline. Enfin tu purifies tes deux chaînes et tu les mets en milieu oxydant pour faire les ponts disulfures, nécessaires à l'activité de l'insuline. Les ponts disulfure ce sont des liens entre deux cystéine et il faut un environnement oxydant.
On peut imaginer que le bromure de cyanogène détruise les méthionine des chaines d'insuline également, ce qui serait un gros problème, mais l'insuline ne renferme pas de méthionine dans sa structure primaire.
Merci pour cette réponse
