Mécanisme réactionnel site actif d'une phosphatase

[jordant]

Bonjour, je suis étudiant en biologie et je sais pas trop où poser ma question qui est à l'interface entre la biochimie et la chimie mais je pense avoir plus de chance en section chimie ^^
Je travaille sur la phosphatase alcaline dans le cadre d'un TP et je tente de comprendre le mécanisme réactionnel de l'hydrolyse du PNPP en PNP + Pi.

Voilà le site actif de l'enzyme avec en rouge le substrat PNPP, j'ai l'impression de reconnaître une substitution nucléophile de type SN2 avec la formation d'un état de transition et d'une molécule plane (le phosphate), le nucléophile serait la fonction alcool du résidu sérine, l'électrophile serait le phosphore du phosphate possédant une charge partielle positive et le groupe partant serait donc le PNP ?



Mais alors où intervient l'eau qui est indispensable dans une réaction d'hydrolyse ?
Quels sont les rôles des deux atomes de Zinc et de Magnésium ? Établir la structure du site actif par l'établissement de complexes de coordination avec les acides aminés ?

Merci à ceux qui pourront m'éclairer
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[vpharmaco]

Mais alors où intervient l'eau qui est indispensable dans une réaction d'hydrolyse ?

Comme tout bon catalyseur, il faut régénérer l'enzyme à la fin de la réaction. Le mécanisme présenté dans le schéma conduit à la phosphorylation de l'enzyme sur un résidu sérine. L'eau permet d'hydrolyser la liaison sérine-phosphate pour libérer le phosphate et l'alcool de la sérine.

Quels sont les rôles des deux atomes de Zinc et de Magnésium ? Établir la structure du site actif par l'établissement de complexes de coordination avec les acides aminés ?

Merci à ceux qui pourront m'éclairer

C'est moi ou ce sont des questions directement tirées d'un exercice ? Comme toujours, montre nous ce que tu as trouvé et où tu bloques. Quel va être l'effet de la coordination de ces cations métalliques sur le caractère electrophile du groupement phosphate? sur le pKa de la molécule d'eau?

[jordant]

Merci de ton intervention, donc si j'ai bien compris par rapport au rôle de la molécule d'eau, dire: "La phosphatase permet d'hydrolyser la liaison phosphoester du PNPP" serait en toute rigueur faux ?
La rupture de la liaison phosphate-PNP serait due au mécanisme de substitution nucléophile, et c'est uniquement la liaison sérine-phosphate qui est hydrolysée pour régénérer l'enzyme ?

Par rapport au rôle des cations, j'observe des liaisons de coordinations entre le Mg2+ et des acides aminés mais aussi trois molécules d'eau. Ces liaisons auraient donc un rôle de maintiens du cation au sein de l'enzyme en tant que co-facteur ?
Pour les molécules d'eau, est-ce que ça serait pas la charge du Mg2+ qui attirerait les électrons vers l'atome d'oxygène et donc rendrait les deux protons davantage labiles ? Donc diminution du pKa du couple H2O/OH-, cela permettrait donc à l'eau de céder des protons qui seraient captés par l'alcool de la sérine et du phosphate impliqué dans la liaison.

Pour les Zn2+, peut-être qu'ils permettent d'attirer les électrons du phosphate et donc d'appauvrir le phosphore en électrons ce qui augmente son caractère électrophile ? C'est peut-être aussi le rôle du résidu Arg166 ?

[vpharmaco]

oui, c'est tout à fait cela.
Je pense que l'on peut tout de même dire que la "phosphatase permet (plus précisément, catalyse) l'hydrolyse de la liaison phosphodiester de PNPP". C'est ce que traduit l'équation bilan de la réaction: PNPP +H₂O donne P + PNP

[A voir en vidéo sur Futura]

[jordant]

Merci beaucoup ! Une dernière chose, on dit que les enzymes (et les catalyseurs en général) n'influencent pas la thermodynamique d'une réaction mais uniquement sa cinétique.
Ce qui veut dire que le PNPP s'hydrolyse spontanément sans enzyme mais cela demande plus de temps, mais du coup qu'est-ce qui déstabilise la liaison phosphate-PNP si ce n'est pas l'attaque d'un nucléophile, la liaison en elle-même serait instable ? Et l'eau est sous sa forme H2O sans l'action du Mg2+, l'autoprotolyse suffirait donc pour fournir des protons au phosphate et à l'alcool du PNP après rupture de la liaison ?

[HarleyApril]

...mais du coup qu'est-ce qui déstabilise la liaison phosphate-PNP si ce n'est pas l'attaque d'un nucléophile, la liaison en elle-même serait instable ?

Tu as répondu toi-même à cette interrogation !

Pour les Zn2+, peut-être qu'ils permettent d'attirer les électrons du phosphate et donc d'appauvrir le phosphore en électrons ce qui augmente son caractère électrophile ? C'est peut-être aussi le rôle du résidu Arg166 ?

Par contre ...

Et l'eau est sous sa forme H2O sans l'action du Mg2+, l'autoprotolyse suffirait donc pour fournir des protons au phosphate et à l'alcool du PNP après rupture de la liaison ?

Il faut voir qu'après l'échange de phosphate qui se retrouve sur la sérine, le groupement para nitrophénol s'en va. Il est vraisemblable qu'une molécule d'eau va ensuite venir se lier au zinc et réaliser l'hydrolyse de la sérine phosphorylée.
Les autres molécules d'eau que tu cites ne sont pas bien localisées pour réaliser une attaque du phosphate à l'opposé du groupe partant.

Bonne continuation

[jordant]

Merci HarleyApril, mais du coup quelles sont les affirmations fausses dans mon deuxième message tu as semé le doute dans mon esprit ^^

[HarleyApril]

ce n'est sans doute pas l'eau lorsqu'elle est liée au magnésium qui vient hydrolyser le phosphate sur la sérine, mais plutôt une molécule d'eau activée par le zinc de droite sur ton schéma

cordialement