Technique PCR

[Freders]

Bonjour,
Besoin d'un peu d'aide pour un exo sur la PCR.

"On représente les séquences nucléotidiques encadrant une séquence d'ADN de 245 pb dont l'enchainement de nucléotides n'est pas précisé :

5'- AAATTCGTATGCTGGGCCTAATC [295pb] TAGCCTAGGGTTACTATTTCAACCCGG -3'

On souhaite amplifier in vitro cette région du génome en utilisant la technique PCR."

Les 2 amorces sont :
A : GGGTTGAAATAGTAACCC
B: AAATTCGTATGCTGGGCC

Pourquoi, pour l'amorce 1, on a "supprimé" les 2ers nucléotides GG ? Pour moi l'amorce aurait du être CCGGGTTGAAATAGTAACCC.
C'est le 1er problème.

Puis, on me demande "quelle sera la taille du fragment d'ADN amplifié?"
On serait tenté de dire 281pb en comptant seulement les amorces, mais la réponse est 293pb car il faut compter l'ensemble.
Encore une fois, pourquoi a-t-on supprimé les 2er nucléotides GG, car cela aurait du faire 295pb

L'explication doit être sûrement toute simple, mais je ne la trouve pas.
Je compte sur vous

[Marina dsf]

Bonsoir à toi Fredres,
Il me semble que la longueur du fragment amplifié correspond au nombre de dNTP compris entre tes deux amorces.

5'- AAATTCGTATGCTGGGCCTAATC [295pb] TAGCCTAGGGTTACTATTTCAACCCGG -3'

Amorce A
Amorce B

Si ton [295pb] est une série de dNTP compris entre tes deux amorces, je dirais qui faut que tu ajoutes TAATC (5) et TAGCCTA (7).
Donc moi j'aurai donné un nombre bien supérieur a savoir 307, mais étant donné que moi et la Bio.Mol. on est pas très très pote, je te dirais de voir ce qu'en disent les autres utilisateurs.
(Comme ça, si j'ai pas pigé le truc moi non plus j'aurais mon explication lol)

Voilà bonne soirée !
PS: je ne sais pas du tout pourquoi les deux G en 3' on était virés les pauvres

[Freders]

Euh mince je me suis trompé, c'est :

5'- AAATTCGTATGCTGGGCCTAATC [245pb] TAGCCTAGGGTTACTATTTCAACCCGG -3'

ce qui donne 245pb + ce qui a avant et ce qui a après = 293pb

Oui j'ai bien compris le principe de la PCR mais je ne comprend pas pourquoi les 2 G sont partis.

Merci quand même

[MaliciaR]

Pour les deux G, tu ne sais pas ce qu'il y a apres. Parfois, si la sequence est un peu "bizarre", tu ne fais pas les amorces continuer pour ne pas avoir des problemes d'appariement. Ou tout simplement, tu essaies que tes amorces ne fassent pas 100 nt non plus Ici, elles ont une taille raisonnable (18 nt), je suppose des Tm compatibles, alors que ce n'est ptet pas le cas avec les 2 G. Ca peut etre un bon exo ca, d'ailleurs : calcule les Tm et regarde ce qu'il en est avec et sans les 2 G.

[Freders]

Tm = (nA + nT) * 2°C + (nG + nC) * 4°C

Amorce 1 : 9 * 2°C + 9 * 4°C = 54°C
Amorce 2 : 10 * 2°C + 8 * 4°C = 52°C (sans les 2G)

Amorce 2 : 10 * 2°C + 10 * 4°C = 60°C (avec les 2G)

C'est sûrement pour avoir un Tm le + proche possible que les 2G ont été supprimés...
Merci

[MaliciaR]

C'est sûrement pour avoir un Tm le + proche possible que les 2G ont été supprimés...
Merci

Voila que tout a une explication.

[Freders]

Ok Merci de m'avoir aidé

[Marina dsf]

C'est ce que je m'etais dit apres avoir posté, je suis allé voir si les Tm etaient Ok, c'etait le cas, mais je ne pensais pas qu'on avait le droit de "bidouiller" comme ca les amorces lol.
Bonne continuation, et bons exam's si c'est le cas pour certain d'entre vous.
Pour ma part mon exam de bio mol d'aujourd'hui a été annulé pour cause d'intempéries: Yahou !