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intro TP

  1. pegazoulleeuh

    Date d'inscription
    novembre 2009
    Messages
    40

    intro TP

    bonjour,
    j'ai besoin de vos avis concernant mon introduction de tp.
    est ce que sa vous parait lourd et mal amener ou est ce que vous comprenez de quoi va parler mon tp ?




    Existant à l'état naturel, les plasmides sont très utilisés dans les laboratoires comme vecteur de clonage. Le clonage correspond a l'amplification ou la multiplication d'un élément génétique déterminé et isolé. Pour un certain nombre de manipulations ( digestion enzymatique, transformation, etc.) il n'est pas nécessaire d'avoir une grande quantité d'ADN plasmidique purifié; aussi des techniques rapides (mini lysats, mini préparations) ont été mises au point pour obtenir rapidement de petites quantités de plasmides relativement pures. Toute procédure concernant l'isolement de l’ADN plasmidique comporte nécessairement la croissance bactérienne, la lyse cellulaire, et la purification de l'ADN plasmidique.
    L'objectif sera donc d'extraire l'ADN plasmidique des bactéries afin de vérifier la présence du plasmide et de l'insert dans les bactéries.
    Pour obtenir des plasmides purifiés a partir des cultures bactériennes, l'utilisation d'un kit Qiagen sera nécessaire ici. Ainsi, après avoir récupéré nos plasmides purifiés, une digestion enzymatique de l'ADN plasmidique sera faite pour repérer la présence de l'insert lors de la migration. Les enzymes de restrictions sont des enzymes bactériennes qui reconnaissent des séquences spécifiques sur l’ADN de 4 à 8 paires de bases, et qui clivent l’ADN sur les deux brins au niveau de ces sites. Nous disposons de plasmide contenant un fragment d'ADN particulier, que l'on nomme insert, et de plasmide ne contenant pas d'insert. Grâce à une purification et une digestion enzymatique des plasmides, nous pourrons vérifié la présence ou non d'insert dans les bactéries en réalisant une migration éléctrophorétique.




    merci de vos avis et remarques CONSTRUCTIVES !

    -----

     


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  2. pegazoulleeuh

    Date d'inscription
    novembre 2009
    Messages
    40

    tp intro plasmide et insert

    bonjour,
    j'ai besoin de vos avis concernant mon introduction de tp.
    est ce que sa vous parait lourd et mal amener ou est ce que vous comprenez de quoi va parler mon tp ?




    Existant à l'état naturel, les plasmides sont très utilisés dans les laboratoires comme vecteur de clonage. Le clonage correspond a l'amplification ou la multiplication d'un élément génétique déterminé et isolé. Pour un certain nombre de manipulations ( digestion enzymatique, transformation, etc.) il n'est pas nécessaire d'avoir une grande quantité d'ADN plasmidique purifié; aussi des techniques rapides (mini lysats, mini préparations) ont été mises au point pour obtenir rapidement de petites quantités de plasmides relativement pures. Toute procédure concernant l'isolement de l’ADN plasmidique comporte nécessairement la croissance bactérienne, la lyse cellulaire, et la purification de l'ADN plasmidique.
    L'objectif sera donc d'extraire l'ADN plasmidique des bactéries afin de vérifier la présence du plasmide et de l'insert dans les bactéries.
    Pour obtenir des plasmides purifiés a partir des cultures bactériennes, l'utilisation d'un kit Qiagen sera nécessaire ici. Ainsi, après avoir récupéré nos plasmides purifiés, une digestion enzymatique de l'ADN plasmidique sera faite pour repérer la présence de l'insert lors de la migration. Les enzymes de restrictions sont des enzymes bactériennes qui reconnaissent des séquences spécifiques sur l’ADN de 4 à 8 paires de bases, et qui clivent l’ADN sur les deux brins au niveau de ces sites. Nous disposons de plasmide contenant un fragment d'ADN particulier, que l'on nomme insert, et de plasmide ne contenant pas d'insert. Grâce à une purification et une digestion enzymatique des plasmides, nous pourrons vérifié la présence ou non d'insert dans les bactéries en réalisant une migration éléctrophorétique.




    merci de vos avis et remarques CONSTRUCTIVES !
     

  3. piwi

    Date d'inscription
    janvier 2005
    Localisation
    Strasbourg
    Âge
    39
    Messages
    7 852

    Re : tp intro plasmide et insert

    C'est marrant le TP "apprend à utiliser un kit". Vachement intéressant...
    Bon c'est un détail qui n'a rien à voir avec vous.

    Sinon, pour le premier paragraphe on comprend ce que vous allez faire mais les phrases semblent dans le désordre. On parle des plasmides, du clonage, et de la croissance bactérienne. C'est étrange, quelque chose ne colle pas.
    Vous insistez sur le fait qu'il n'est pas nécessaire d'avoir de grandes quantité de vecteur. Mais cette remarque vient comme un cheveux dans la soupe. Je crois qu'il faut noter que faire une maxiprep était largement plus contraignant il y a quelques années qu'aujourd'hui. Ce n'est pas tant une question de volumes mais de procédures qui a conduit les personnes à mettre au point des protocoles simplifiés. Ces protocoles rendent des produits moins propres mais ils sont plus simples à mettre en œuvre et permettent d'avancer.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
     

  4. pegazoulleeuh

    Date d'inscription
    novembre 2009
    Messages
    40

    Re : tp intro plasmide et insert

    c'est ironique le KIT ? sa sert a rien d'en parler peut être ?

    pour le premier paragraphe justement je trouve qu'il manque un truc pour relier le tout mais j'arrive pas a mettre un ordre dans tout ca ..
     

  5. piwi

    Date d'inscription
    janvier 2005
    Localisation
    Strasbourg
    Âge
    39
    Messages
    7 852

    Re : tp intro plasmide et insert

    En fait, il n'est pas nécessaire ni d'utiliser un kit qiagen, ni d'utiliser un kit tout simplement. Ce qui est nécessaire c'est de lyser les cellules et dénaturer les macromolécules par le NaOH et le SDS avant de tamponner le pH avec de l'acétate pour permettre aux macromolécules de se renaturer et ce faisant de précipiter. Comme l'ADN plasmidique est petit devant l'ADN génomique, il ne précipite pas avec et reste en solution. C'est cette solution que l'on récupère et dont on purifie l'ADN qui s'y trouve (ADN plasmidique). Pour réaliser cela, vous avez utilisez un kit, on aurait très bien pu le faire à l'ancienne (d'expérience, je trouve que ça fonctionne d'ailleurs mieux à l'ancienne qu'avec des kits).

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
     


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  6. pegazoulleeuh

    Date d'inscription
    novembre 2009
    Messages
    40

    Re : tp intro plasmide et insert

    a oui d'accord je l'ai mis parce que je m'en suis servi dans ma manip en faite !

    sinon pour amener le sujet vous auriez pas des pistes pour améliorer mon introduction ?

    merci
     

  7. Edelweiss68

    Date d'inscription
    août 2009
    Messages
    7 232

    Re : intro TP

    Bonjour,

    Alors rapidement et de façon non exhaustive.

    Citation Envoyé par pegazoulleeuh Voir le message
    Existant à l'état naturel, les plasmides sont très utilisés dans les laboratoires comme vecteur de clonage.
    J'aurais mis : les plasmides sont (définition) existant à l'état naturel et très utilisés...

    Le clonage correspond a l'amplification ou la multiplication d'un élément génétique déterminé et isolé.
    Le terme amplification me fait plutôt penser à de la PCR. Cela ne concerne pas forcément qu'un gène.(cellule ou organisme)

    Pour un certain nombre de manipulations ( digestion enzymatique, transformation, etc.) il n'est pas nécessaire d'avoir une grande quantité d'ADN plasmidique purifié;
    J'aurais mis "étapes" plutôt que manipulations mais c'est juste comme ça. Vous voulez insister sur le fait qu'on ne nécessite pas beaucoup de matériel génétique ? Ou que celui ci n'a pas besoin d'être très purifié ? Ou les deux ?

    aussi des techniques rapides (mini lysats, mini préparations) ont été mises au point pour obtenir rapidement de petites quantités de plasmides relativement pures.
    Mises en œuvre plutôt que mises au point, à moins que vous n'ayez vous même optimisé ces techniques. Et j'aurais mis d'une "pureté satisfaisante" plutôt que "relativement pure". (encore une fois c'est peut-être subjectif mais bon !).

    Toute procédure concernant l'isolement de l’ADN plasmidique comporte nécessairement la croissance bactérienne, la lyse cellulaire, et la purification de l'ADN plasmidique.
    Plutôt, l'obtention d'ADN purifié nécessite au préalable...

    L'objectif sera donc d'extraire l'ADN plasmidique des bactéries afin de vérifier la présence du plasmide et de l'insert dans les bactéries.
    Est-ce l'objectif final ? N'allez vous pas produire une protéine recombinante ? Ou le TP est-il fractionné ? Ou limité à cette étape ?

    Pour obtenir des plasmides purifiés a partir des cultures bactériennes, l'utilisation d'un kit Qiagen sera nécessaire ici.
    Un kit Qiagen a été utilisé.

    Ainsi, après avoir récupéré nos plasmides purifiés, une digestion enzymatique de l'ADN plasmidique sera faite pour repérer la présence de l'insert lors de la migration.
    Vérifier la présence de l'insert lors de la migration... de quoi? de qui ? où ?

    Nous disposons de plasmide contenant un fragment d'ADN particulier, que l'on nomme insert,
    Insert = séquence d'intérêt

    et de plasmide ne contenant pas d'insert.
    Et servant de témoin ?

    Grâce à une purification et une digestion enzymatique des plasmides, nous pourrons vérifié la présence ou non d'insert dans les bactéries en réalisant une migration électrophorétique.
    Migration sur quoi ?
    H u m a n i t y
     

  8. pegazoulleeuh

    Date d'inscription
    novembre 2009
    Messages
    40

    Re : intro TP

    merci
    je vais reprendre mon introduction et remettre tous ca dans l'ordre

    sinon pour l'objectif on s'arrête a une migration en gel d'agarose de nos plasmides digéré et non digéré !

    petite question qui n'a rien a voir mais peut on vraiment dire qu'il y a un insert en lisant une électrophorèse ?!
     


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