Clonage et PCR

[phasmedu70]

Bonjour,

J'aurais besoin de votre aide en ce qui concerne le DM que j'ai à rendre.

Je bloque dans la partie 1 aux questions 1.3, 1.4, 1.5, et 1.6.
Pour la question 1.3, je pense que la digestion doit être réalisée par les enzymes Hind III et BamH I car on les retrouve sur le plasmide pUC18 dans le site MCS. Est-ce que cela vous paraît juste ?
Pour la question 1.4, je retrouve bien le site de restriction de Bgl II sur la séquence des amorces, ainsi que celle d'EcoRI mais je ne vois pas celle de BamH I.
Pour la question 1.6, je pense que le tampon 2 doit être utilisé car il offre une activité supérieure à 50% pour les 3 enzymes, cependant je ne sais pas si ces 3 enzymes doivent avoir une activité élevée pour la digestion de l'amplicon et pour la digestion du vecteur.

Dans la partie 2, je ne comprend absolument rien


Merci d'avance pour votre aide !
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[Yoyo]

salut

1.3 HindII et BamHI sont dans ton gène, si tu les utilises tu ne cloneras jamais le gène entier. Une piste, regarde la sequence en gras dans les primers utilisés
En plus tu as deja toute la réponse de fourni dans la partie en anglais au debut de l'annexe1

1.4: ben la tu n'as qu'a regarder les deux sites et dire ce que tu en penses... dessine la coupure ca t'aidera. BamHI est sur le plasmide puC18...
1.5: la tu y arriveras quand tu auras compris la question 1.4
1.6: la digestion de l'insert et du plasmide se font dans deux tubes séparés! donc tu n'as pas chercher un tampon qui donne 100% d'activité pour toutes tes enzymes mais uniquement pour les enzymes utilisées en meme temps.

Pour les questions 2.
2.1 c'est surement du cours car tu ne peux pas inventer le nom.
2.2. on te donne les bornes des domaines, ensuite on te demande de dire si tous les domaines existe dans cette nouvelle protéine.

Yoyo

[phasmedu70]

D'accord merci beaucoup pour ton aide !

1.3 L’amplicon doit subir une double digestion par les enzymes EcoR I et Bgl II, car l’amorce sens créer un site de restriction unique de l’enzyme de restriction EcoR I et l’amorce anti-sens créer un site de restriction unique de l’enzyme de restriction Bgl II. , c'est bien ça ?

1.4 Les enzymes de restriction BamH I et Bgl I réalisent toutes deux des coupures décalées côté 5’, donnant des extrémités débordantes.
Leurs sites de restriction différent de deux bases : la première (A chez Blg II et G chez BamH I) et la dernière (T chez Bgl II et C chez BamH I).
Ces deux enzymes sont retenues pour le clonage en plus d’EcoR I, car l’amplicon possède un site de restriction unique de l’enzyme de restriction Bgl II, et le plasmide pUC18 possède un site de restriction unique de l’enzyme de restriction BamH I. De plus, l’amplicon et le plasmide pUC18 possèdent tous deux un site de restriction unique de l’enzyme de restriction EcoR I.
Es-tu d'accord avec ça ?

1.5 Là je vois bien les coupures obtenues avec les deux enzymes :

Bgl II : 5' A 3' 5' GATCT 3'
3' TCTAG 5' 3' A 5'

BamH I : 5' G 3' 5' GATCC 3'
3' CCTAG 5' 3' G 5'

Mais je ne vois pas comment ils peuvent se réarranger

1.6 Je pensais dire que pour la digestion de l'amplicon il fallait utilisé la tampon 3, et pour la digestion du vecteur il faut utiliser le tampon 1 ou 2 : je ne sais pas si il faut que l'enzyme qui n'est pas utilisée ait un % d'activité faible ou si cela n'est pas important ?

2.1 Je pensais à Primer 3 Plus, je ne sais pas si tu connais ?

2.2 Je ne comprend pas bien ce que représentent les * et les ---, est-ce que les * correspondent aux bases identiques et les --- aux bases complémentaires ?

[phasmedu70]

Au final, après une demi-heure de réflexion et des petits dessins j'ai enfin compris comment s'apparient des deux morceaux générés par les enzymes Bgl II et BamH I !
Vive les dessins...

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

Salut

Bravo!
C'est tout bon. Pour la 1.6 non ce n'est pas nécessaire.
2.1 Je sais pas, ca dépend de quels programmes on vous a parlé en cours
2.2 * signifie que les acides aminés sont identiques, et - que ca n'est pas le cas.

YOyo

[phasmedu70]

Woooh, serais-je en train de devenir douée en bmgg...

D'accord, merci beaucoup !
Et du coup pour la question 2.2, faut-il que tous les acides aminés sans exception soient identiques pour qu'un domaine soit présent, ou y-a-t'il une règle pour cela ?

[phasmedu70]

En cherchant un peu sur internet j'ai trouvé un pourcentage : "on ne peut déterminer un pourcentage de ressemblance à partir duquel les gènes seront considérés comme homologues, contrairement aux protéines homologues qui doivent présenter au moins 20 % de similitude"

Penses-tu que c'est de ce pourcentage dont il faut que je me serve ?

Si c'est le cas, je trouve 33.44% d'homologies pour les acides aminés 1 à 323, 12.95% pour les aa 324 à 517, et 45,21% pour les aa 521 à 928.
Les domaines des acides aminés 1 à 323 et 521 à 928 seraient donc susceptibles d'être retrouvés dans la Taq polymérase.

[phasmedu70]

En faite je trouve 48.65% pour la dernière séquence d'aa.

[phasmedu70]

Je me suis renseigné auprès d'une de mes prof, et elle m'a dit que la réponse se trouvais dans le document que je vous joins... Malheureusement je ne vois pas la réponse dans ce document

[Yoyo]

Salut

Je pense que tu as bon, c'est le deuxième domaine qui n'existe pas dans la nouvelle séquence. Il faut que tu regardes les fonctions de ces domaines pour en conclure quelquechose d'intéressant.

YOyo

[phasmedu70]

D'accord, encore merci pour ton aide qui m'a beaucoup aidé !

[phasmedu70]

Est-ce que tu saurais juste où je peux trouver la fonction des domaines de l'ADN polymérase I d'E.coli ?

[Yoyo]

Est-ce que tu saurais juste où je peux trouver la fonction des domaines de l'ADN polymérase I d'E.coli ?

Ils sont indiqués dans le tableau du paragraphe 2

YOyo

[phasmedu70]

Ah oui pardon ! Merci beaucoup