Application de la PCR à la vérification des clonages

[softy2901]

Bonjour,
j'ai un partiel mercredi prochain en biologie moléculaire et je ne comprend pas une partie d'un exercice. Pourriez vous m'éclairer svp?
Voici l'exercice :

Vous devez amplifier, par PCR, le gène codant pour la protéine CENP-A dont la séquence est donnée ci-dessous. Les nucléotides en majuscules correspondent à la région codante et les nucléotides en minuscules correspondent aux régions 5' et 3 non codantes.
1 gcaggagccgtgggaccgggcgccagcacc ctctgcggcgtgtcATGGGCCCGCGCCGCC GGAGCCGAAAGCCCGAGGCCCCGAGGAGGC GCAGCCCGAG
101 CCCGACCCCGACCCCCGGCCCCTCCCGGCG GGGCCCCTCCTTAGGCGCTTCCTCCCATCA ACACAGTCGGCGGAGACAAGGTTGGCTAAA GGAGATCCGA
201 AAGCTTCAGAAGAGCACACACCTCTTGATA AGGAAGCTGCCCTTCAGCCGCCTGGCAAGA GAAATATGTGTTAAATTCACTCGTGGTGTG GACTTCAATT
301 GGCAAGCCCAGGCCCTATTGGCCCTACAAG AGGCAGCAGAAGCATTTCTAGTTCATCTCT TTGAGGACGCCTATCTCCTCACCTTACATG CAGGCCGAGT
401 TACTCTCTTCCCAAAGGATGTGCAACTGGC CCGGAGGATCCGGGGCCTTGAGGAGGGACT CGGCTGAgctcctgcacccagtgtttctgt cagtctttcc

Écrivez la séquence des amorces "forward" (aller) et "reverse" (retour) correspondant aux séquences soulignées. Par convention, toutes les séquences d’ADN sont écrites de manière à ce que l'extrémité 5' se situe à gauche. Calculez la température d'hybridation des amorces en utilisant la formule très simplifiée suivante : Tm = 2(A + T) + 4(G + C) °C.
- Amorce forward: (1 point)
Séquence:GCACCCTCTGCGGCGTGTC Température d'hybridation : 2*(1+4) + 4*(6+8) = 66°C

-Amorce reverse : (1 point)
Séquence:GAAACACTGGGTGCAGGAGC Température d'hybridation : 2*(6+2)+4*(8+4)= 64°C
Complétez le tableau ci-dessous mentionnant, pour chaque cycle, les paramètres permettant d'amplifier le gène par PCR. On considère que la Taq polymérase incorpore 1000 nucléotides/minute. Vous indiquerez également le nombre de cycle de PCR à effectuer.
Nom de l'étape Température Durée
1 (1 point) dénaturation de
l’ADN matrice 95°C
2 (1 point) 66°C
3 (1 point)
Nombre de cycle de PCR:
(0,5 point)



Je ne comprend pas comment on détermine la durée de chaque étape ainsi que le nombre de cycle de PCR...

Merci d'avance !!!
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[Flyingbike]

encore un exercice idiot... Vous n'avez pas de chance.

Pour la durée, ben ça dépend, pour l'élongation on compte 1 min/kb en général, il vous suffit de compter le nombre de nucléotides à amplifier, pour le reste, c'est a la fois du feeling et de l'optimisation et ça dépend de beaucoup de paramètres.

66° ça vient de vous ? Il faut un Tm inférieur au Tm des amorces, sinon pas d'hybridation (là encore ça pourrait marcher a 66, a 64 ou même à 60 on peut pas deviner...)

Et enfin pour le nombre de cycle, ca dépend.... Le protocole de base préconise 30, mais je ne vois pas en quoi c'est intéressant de vous demander ça surtout qu'on ne peut pas le deviner ni le déduire de vos données...

[softy2901]

Non pas de chance, sans compter le fait que mettre un exercice sans correction n'est pas super pour comprendre ...

Pour l'élongation je comprend mais pour la dénaturation et l'hybridation je vois pas comment faire ..

Oui le 66 degrés vient de moi, d'accord je n'avais pas bien compris la notion alors

Pour le nombre de cycles dans mon cours il est marqué entre 25 et 30 cycles en général , donc c'est ce que je pensais mettre comme réponse

[Flyingbike]

classiquement pour le temps de dénaturation et d'hybridation on est entre 15sec et 1 min... Il n'y pas de bonne réponse je dois dire.

en température, si je devais faire une PCR test, je mettrais 63° personnellement


Vous êtes dans quelle licence ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[softy2901]

D'accord j'en prend note merci !


Licence STS SVT parcours biologie

Mon examen est une épreuve écrite des méthodes expérimentales en biologie, j'ai de la biochimie de la biologie cellulaire et de la biologie moléculaire

Je peux aussi bien tomber sur des principes à expliquer que sur des petits exercices comme cela, mais j'ai l'impression qu'il me manque des données à chaque fois par rapport à la façon dont je l'ai fait en TP donc je me retrouve bloquée