Levures et TAP tag à grande échelle

tortuga · 20/04/2005, 17h55

Bonjour!

Comment fait-on du TAP tag (tandem-affinity purification) à grande échelle?

Dans un article (Gavin et al. (2002) Nature 415:141-7), ils disent qu'ils ont branché l'étiquette TAP à l'extrémité C-terminale des ORF de gènes de levures.

Cela veut donc dire que l'on insère une étiquette TAP sous forme d'ADN directement dans le gène, qui va être transcrite et servir pour la purification après?

Merci, bonne journée!

tortuga · 20/04/2005, 18h00

OK! Désolé...
Je crois que je viens de comprendre

**Yoyo** · 21/04/2005, 00h11

Oui c'est exactement cela.
Il existe une collection de levures ayant des genes taggés en Ct par le TAP-TAG. il est ensuite possible de purifier les proteines.

YOyo

nayeki · 21/04/2005, 00h44

Hello,

dans le même esprit il existe une collection de levures où "toutes" les orf sont fusionnées à la GFP...

Y'a un site web d'ailleurs, faut que je le retrouve

tortuga · 21/04/2005, 01h41

Citation:

Posté par Yoyo

Oui c'est exactement cela.
Il existe une collection de levures ayant des genes taggés en Ct par le TAP-TAG. il est ensuite possible de purifier les proteines.

Merci pour cette confirmation!

Dans mon cours en revanche, c'est écrit que le but du TAP-tag à grande échelle est "d'assigner des fonctions aux protéines et de voir leurs interactions"... En fait, je comprends parfaitement la technique du TAP tag (purification ou même élimination d'une protéine cible avec billes d'IgG et de calmoduline) mais en revanche, je vois mal comment identifier des protéines et leurs interactions avec cette technique

Merci et bonne journée!

tortuga · 21/04/2005, 01h42

Citation:

Posté par nayeki

Hello,

dans le même esprit il existe une collection de levures où "toutes" les orf sont fusionnées à la GFP...

Y'a un site web d'ailleurs, faut que je le retrouve

oui! trouve!

nayeki · 21/04/2005, 15h30

Hello

TAP tag collection : http://www.openbiosystems.com/yeast-...on-library.php

GFP et GST fusions:
http://www.dbsr.duke.edu/yeast/Genom...s/exclones.htm

Deletion library:
http://www-sequence.stanford.edu/gro...eletions3.html

Site très utile:
http://www.yeastgenome.org/VL-yeast.html#buds

vero0oo · 21/04/2005, 23h21

Bonsoir,

Citation:

En fait, je comprends parfaitement la technique du TAP tag (purification ou même élimination d'une protéine cible avec billes d'IgG et de calmoduline) mais en revanche, je vois mal comment identifier des protéines et leurs interactions avec cette technique

La technique du TAP-tag permet bien de purifier des complexes entiers! On utilise une protéine fusionnée au tag comme appat, et au bout de deux purifications (colonne d'IgG et colonne de calmoduline), on considère que les protéines co-purifiées interagissent de manière assez spécifique avec la protéine d'intérêt pour qu'elles forment réellement un complexe.
Comme confirmation, on utilise comme appat toutes les protéines du complexe supposé, successivement : normalement, on doit obtenir le même ensemble de protéines à chaque fois.

La technique est utile pour émettre des hypothèses sur la fonction d'une protéine inconnue : en trouvant dans un même complexe des protéines de fonction connue, on peut avoir une idée de la fonction de la protéine d'intérêt.

Par rapport à une co-immunoprécipitation, il y a deux purifications successives : c'est plus spécifique.

vero0oo

nayeki · 22/04/2005, 00h54

Citation:

Posté par vero0oo

Bonsoir,

La technique du TAP-tag permet bien de purifier des complexes entiers! On utilise une protéine fusionnée au tag comme appat, et au bout de deux purifications (colonne d'IgG et colonne de calmoduline), on considère que les protéines co-purifiées interagissent de manière assez spécifique avec la protéine d'intérêt pour qu'elles forment réellement un complexe.
Comme confirmation, on utilise comme appat toutes les protéines du complexe supposé, successivement : normalement, on doit obtenir le même ensemble de protéines à chaque fois.

La technique est utile pour émettre des hypothèses sur la fonction d'une protéine inconnue : en trouvant dans un même complexe des protéines de fonction connue, on peut avoir une idée de la fonction de la protéine d'intérêt.

Par rapport à une co-immunoprécipitation, il y a deux purifications successives : c'est plus spécifique.

vero0oo

Tu oublies un détail essentiel, c'est la détection des protéines co-purifiées....

Ca se fait par Spectro de Masse, et c'est pas joué d'avance, loin s'en faut

tortuga · 22/04/2005, 06h31

Merci pour vos réponses complètes et claires.
Merci Nayeki pour ces adresses excellentes!