[Bio] [M1-M2] pcr

[piwi]

Ce petit exercice vous propose deux questions de cours indispensables. La troisième question peut être une question de cours si vous avez les connaissances théoriques ou alors une questions de réflexion intéressante si vous ne connaissez pas la méthode exacte.

I. Décrivez succinctement le principe et les différentes étapes de la PCR.
II. Décrivez les différentes phases d’accumulation de l’ADN.
III. En partant du principe de la PCR et en exploitant les propriétés que vous avez décrites pouvez vous proposer un principe expérimental permettant une quantification relative d’un ARN donné devant un autre ?
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[invitead282ff2]

Je suis titulaire d'une licence de biochimie..disons, que j'ai un niveau de M1 grosso modo.

J'ai revu la pcr ce matin...on va voir ce qu'il m'en reste.

I. Décrivez succinctement le principe et les différentes étapes de la PCR.

Principe de la PCR:
Grace à l'hybridation spécifique de deux amorces des deux cotés du gène (ou partie de gène) que l'on désire amplifier, on réalise un grand nombre de cycle de réplication (environs 30) grace à une ADN polymérase termo résistante.

Les différentes étapes sont:
1) Dénaturation de l'ADN (environs 95°C)
2) Hybridation des amorces sur l'ADN
3) Baisse de la température vers 75°C, polymérisation des brins complémentaires par la TAC poly
4)Retour vers 1)

Toutes les étapes doivent se dérouler en présence d'un milieu tamponé légèrement acide, d'ions Mg2+, dNTP en excès, molécules d'ADN en faible concentration dont on souhaite amplifié l'un des gène .

II. Décrivez les différentes phases d’accumulation de l’ADN.

Au 1er cycle, il y a amplifaction de 2 gènes cibles et 2 ADN complets
Au 2eme cycle, on obtient 4 gènes cibles amplifiés, 4 ADN complets
Au 3eme cycle, 8 gènes amplifié, 6 ADN complets
Au 4eme cycle, 16 " ", 8 ADN " "
Au 5eme cycle, 32 " ", 10 ADN " "
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Au 10eme cycle, 1024 " ", 20 ADN " "
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Au dernier cycle, plus de 1 000 000 de gènes amplifiés, 60 ADN complet.

Bon, pour faire simple, le gène est amplifié d'un facteur 2^n (oû n correspond au nombre de cycle), la molécule d'ADN dans son intégralité d'un facteur 2xn.
Tout ceci n'est que théorique.
Au fur et à mesure de cycle, l'ADNpoly est de moins en moins efficace.
De mémoire, y'a qu'environs 10^5 copies de gènes en pratique au lieu du milliard théorique.

III. En partant du principe de la PCR et en exploitant les propriétés que vous avez décrites pouvez vous proposer un principe expérimental permettant une quantification relative d’un ARN donné devant un autre ?

Ben là, je vois pas trop...la PCR ne s'applique qu'a l'amplification d'ADN.
Disons que en partant d'un extrait cellulaire d'ARN, on pourrait peut etre gràace à une transcriptase inverse synthétisé les ADNc correspondants aux ARN présents.

Ainsi, on aura une même proportion d'ADNc que d'ARN. Si un ARN (A) était 20 fois plus transcrits qu'un autre ARN (B), il y aura donc, 20 fois plus d'ADNc (A) que d'ADNc (B) après action de la transcriptase inverse sur notre extrait cellulaire.

Si on applique une PCR à nos ADNc ainsi obtenus (supposant que l'on connaisse les séquences de ces gènes pour permettre l'élaboration des amorces), après un nombre de cycle suffisant (usuellement 30),les ADNc seront en quantité suffisante pour que l'on puisse quantifier leur différence...et ainsi, ramener celà aux ARNs initiaux présent dans nos cellules.

Si nos ARN était présent à un niveau picomolaire difficilement dosable, nos ADNc amplifiés (après 30 cycles de PCR) seront présent à un niveau milimolaire, plus facile à comparer.

Je ne sais pas trop par contre comment séparer et doser nos deux ADNc après amplification.

Peut etre un southern blot, puis une mesure d'absorbance à une longeur d'onde spécifique de l'ADN. Je sais pas laquelle par contre...

Enfion, l'idée est là.

Morphine

[invitead282ff2]

Autocorrection:

C'est la quantité totale d'ADN qui varie en 2^n.
La quantité du gène qu'on souhaite dupliqué varie selon 2^n - 2n.

A part ca, ma défition du principe de la PCR est moyen...

J'aimerai juste savoir pour la question 3) si mon protocole est la bonne solution ou pas.
Le reste, c'a ne reste que du cours....

Merci bien

[piwi]

Je trouve ca pas mal même si je suis d'accord avec vous sur le fait que vous ne decrivez pas bien le principe de la PCR.
Peut être un petit schéma aide il à comprendre ce qui se passe (pas facile sur un forum je vous l'accorde)

--------5'---------------3'--------------
--------3'---------------5'--------------

L'ADN est amplifié àpartir des amorces et la réplication s'arrete aléatoirement.

--------5'---------------3'--------------
------------------------------------------------------------------
-----------------------------------
--------3'---------------5'--------------

On a donc un pool d'ADN de longeurs diverses complémentaires aux deux brins initiaux.
Si le coté 3' du brin est toujours borné par la séquence complémentaire à l'amorce sur le brin de départ le coté 5' est de longeur variable. Cependant, si le brin est assez long, on retrouve en 5' une séquence complémentaire à l'amorce anti sens.

3'|-------------------------------------------------------------5'

Au premier cycle on a donc l'ADN matriciel initial et un pool d'ADN complémentaire à l'ADN initial de longeur variable bornés en 3'

Au second cycle ces ADN vont reservir de matrice. L'ADN initial va amplifier le pool de longeur variable.
Le pool de longeur variable va lui aussi être repliqué:

3'|-------------------------------------------------------------5'
5'|-----------------------------------------------|3'

Sont apparu une troisème population d'ADN de longeur fixe cette fois ci, longeur égale à la distance entre les deux amorces.

Au troisième cycle:
L'ADN matriciel est repliqué en ADN de longeur variable, amplifiant le pool
Le pool de longeur variable génére des ADNs de longeur fixe.
Les ADNs de longeur fixe se repliquent et leur nombre s'amplifie avec les cycles. Comme leur longeur est fixe on peut finir par les voir sous la forme d'une bande en faisant migrer les ADN sysnthétisés au bout de n cycles sur un gel d'agarose + BET dans un champs electrique.

Du coup vous voyez qu'il y a trois phases:
1. les deux premiers cycles qui permettent de sysnthétiser les ADNs de longeur fixe
2. Une phase d'amplifiaction exponentielle que vous avez decrit.
3. Une phase de saturation dont vous avez aussi parlé.

Pour la question de réflexion dans le principe c'est exactement cela.
J'y reviendrai plus tard.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

La question de reflexion proposait d'imaginer le principe de la RT-qPCR.

Vous avez trouver la première partie.
On ne peut pas faire de PCR directement avec les ARNs.
On synthétise donc des cDNAs et l'on va faire des PCRs avec. Mais comment trouver une quantité relative d'ARN?
Simplement en utilisant un gène dont on sait que l'expression ne varie pas. Un gène que l'on connait. Les gènes ménagers (housekeeper genes, les gènes qui tiennent la maison comme la gylceraldehyde deshydrogénase, l'actine, la sous unité 18S des ribosomes ect...) sont particulièrements indiqués pour cela.
On va donc faire une PCR avec ce gène et une avec notre gène d'interet.
Mais en plus on va suivre l'evolution de la PCR cycle par cycle de facon à reperer la phase exponentielle d'amplification (ceci se fait concretement grace à des agents intercallants fluorescents une fois en place sur l'ADN, la fluorescence augmente avec la quantité d'ADN synthétisée). On obtient donc une courbe sygmoïde pour chacun des deux gènes. Plus la courbe apparait tot plus il y a d'ARN dans la solution de départ.
Une fois que l'on est au plateau des deux courbes sygmoïdes on peut faire un rapport des cycles pour lesquels amplitude = (amplitude max)/2 (milieu de la sigmoide en gros).
On a donc evalué une quantité relative d'un ARN par rapport à un autre.

Maintenant reprenons notre gène d'interet. Nous avons deux echantillon, un extrait d'un tissu normal et l'autre issu d'un tissu dont on suppose que la quantité d'ARN du gène d'interet à varié.
Si l'on fait cette RT-qPCR pour chacun des deux echantillons on voit que une variation du rapport gene d'interet/housekeeper gene indique dans quel ordre cette quantité à varié.

[invitead282ff2]

Merci beaucoup pour le temps que vous avez pris pour me corriger.

J'aurais juste une question sur les gènes housekeepers.
Voila ma question:
Afin de comparer le niveau d'expression de nos ARNs, on compare avec un gène dont on sait le niveau d'expression constant.
Je comprend bien celà.

Mon seul "soucis", c'est que je suis "étonné" de voir la sous-unité 18S du ribosomes comme ayant une expression ne variant pas.
Il n'y a pas de rapport entre l'activité d'une cellule et l'expression de 18S? Il me semblerait "logique" qu'une cellule qui aurait un métabolisme très important, ou en constante division, aurait donc un plus grand besoin en protéine, qu'une autre cellule en quiéscence. Et donc, besoin d'un plus grand nombre de ribosomes.

Ou alors, il y a t il toujours un même nombre de ribosomes (donc, toujours en très grand excès) quelque soit le type cellulaire et son activité?


Je ne m'étais jamais posé la question avant...

[piwi]

vous avez raison pour les ribosomes on peut se poser la question. Il y en a toujours beaucoup.

Mais le point n'est pas là. Ces ARNs sont supposés représenter le fond d'activité de la cellule. Ils ont donc une très forte expression d'emblé. Difficile de la modifier.
Toutefois le choix de ces genes de ménage est capitale et doit être réfléchie. Il peut arriver qu'un traitement modifie l'activité de l'un ou l'autre.
Vous ne prendrez pas gapdh si vous savez que vous allez toucher à l'activité de la glycolyse, pas l'actine si vous savez que vous allez modifier l'organisation du cytosquelette et pas l'ARN18S si vous savez que vous allez modifier le taux de traduction global de votre cellule