[Journal Club] Immortalisation & Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques

[invitea0443c8c]

Salut!

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1...ubmed_RVDocSum


Creation of human tumour cells with defined genetic elements.

(Hahn et al. Nature, 1999)

Ce travail est issu du laboratoire de Bob Weinberg au MIT, célèbre (entre autre) pour avoir découvert la mutation Ras V12 au milieu des années 80, et plus globalement pour être certainement le chercheur ayant le plus apporté à la cancérologie au cours des deux dernières décennies (même s’il n’est pas le seul, il reste incontournable). Cette publication plus tardive (1999) s’est très rapidement imposée comme étant une, si ce n’est LA, publication essentielle de la cancérologie moléculaire humaine. C’est la première étude qui a permise de « créer » une cellule cancéreuse humaine à partir d’une cellule humaine normale et surtout, à partir d’éléments génétique bien définis. Le raisonnement, comme beaucoup d’études de gros labos américains, est d’une simplicité et d’une clarté déconcertante à tel point que l’on se demande pourquoi personne n’y avait pensé avant eux (la simplicité est cependant uniquement apparente la plupart du temps et cache souvent de grosses difficultés techniques).

Le principe fonctionne par ajout d’éléments oncogéniques en observant l’effet de ces éléments sur certaines caractéristiques des cellules. Ainsi, deux oncogènes ont été utilisés soit séparément, soit ensemble : H-Ras G12V (H-Ras) et la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT). Deux lignées principales ont été utilisées pour cette étude : les HEK (Human Embryonic Kidney) et les BJ (human fibroblasts). Les cellules sont initialement modifiées par l’antigène T du SV40 qui ne permet pas de les immortaliser mais simplement de passer outre la sénescence (conditions indispensables pour la survie des cellules non immortalisées en culture).

Ce travail peut-être divisé en deux grandes parties.

La première partie de l’étude consiste à introduire les différents éléments dans les cellules HEK et BJ afin d’obtenir différentes lignées possédant H-Ras V12 et/ou Htert avec toutes les combinatoires possibles (-/-, - /+, +/- et +/+). Les expressions de l’Ag T et de H-Ras sont vérifiées par western-blot. L’ajout de la télomérase est validé par RT-PCR et son activité est contrôlée par southern-blot. Les télomères sont allongés dans les cellules modifiées par rapport aux cellules témoins.

La seconde partie du papier est dédiée à l’analyse des propriétés des différentes lignées créées.
Les auteurs réalisent tout d’abord des essais de prolifération en absence de substrat, propriété essentielle des cellules cancéreuses. La méthode utilisée est robuste et largement reconnue pour ce type d’expérience : les cellules sont cultivées dans de l’agar mou (ce qui pour la cellule, correspond à une absence de substrat) et les colonies formées sont comptées. Les résultats de cette première expérience sont nets : seules les cellules qui possèdent à la fois H-Ras et hTERT sont capables de former des colonies dans l’agar. Ce résultat est valable pour les cellules HEK et BJ. Cependant, une petite partie des cellules HEK possédant uniquement H-Ras mais sans la télomérase sont capables de proliférer dans l’agar.
La figure suivante est consacrée à la prolifération des cellules en culture. Seules les cellules immortelles sont capables de proliférer en culture et l’immortalité est également une caractéristique essentielle des cellules cancéreuses. Les auteurs suivent l’évolution de la population sur 125 jours. Là encore le résultat est impeccable : seules les cellules possédant la télomérase sont capables de proliférer en culture. Le statut de Ras n’a aucune influence sur cette prolifération ce qui indique que Ras ne joue pas de rôle majeur dans l’immortalisation des cellules. La double possession de l’Ag T et de la télomérase confère donc l’immortalité aux cellules.
La dernière figure intéresse la transformation tumorale en elle même (après avoir étudié l’immortalisation) et teste la capacité des différentes lignées à former des tumeurs in vivo chez la souris nude immunodéficiente. Les cellules HEK sont donc injectées dans les souris et le volume des tumeurs formées est mesuré régulièrement. Les souris sont sacrifiées lorsque la tumeur dépasse 1 cm de diamètre. Seules (et toutes) les souris à qui l’on a injecté des cellules positives pour H-Ras et hTERT développent des tumeurs.

Les auteurs concluent que l’expression ectopique de l’antigène T, de H-Ras G12V et de hTERT suffit pour convertir une cellule normale en une cellule tumorigène. C’est la première tentative réussi de transformation tumorale dans une cellule humaine.
Il faut toutefois signaler qu’une équipe avait déjà tenté l’expérience en transfectant des fibroblastes humain avec E6/E7 (qui inactivent Rb et p53, donc qui miment l’Ag-T), hTERT et Ras mais sans succès. Ceci est paradoxal avec les résultats de Weinberg dans la mesure où les mêmes voies sont sensées être stimulées ou inactivées dans les deux cas. Weinberg explique la différence par le fait que l’Ag-T, outre l’inactivation de Rb et p53, perturbe également d’autres pathways (contrairement à E6/E7) et suppose donc que parmi ces autres voies certaines doivent être altérées pour que la transformation tumorale se fasse….


V.

[gorben]

Salut,

Bravo pur l'effort. Je trouve ca bien ecrit, bien introduit et clair.

J'ai deux questions naives.
1/ Est ce que le choix du type cellulaire a ete dicte par un interet special, ou c'est juste deux types de cellules qu'ils avaient sous la main?
2/

Les résultats de cette première expérience sont nets : seules les cellules qui possèdent à la fois H-Ras et hTERT sont capables de former des colonies dans l’agar. Ce résultat est valable pour les cellules HEK et BJ. Cependant, une petite partie des cellules HEK possédant uniquement H-Ras mais sans la télomérase sont capables de proliférer dans l’agar.

Le statut de Ras n’a aucune influence sur cette prolifération ce qui indique que Ras ne joue pas de rôle majeur dans l’immortalisation des cellules. La double possession de l’Ag T et de la télomérase confère donc l’immortalité aux cellules.

C'est moi qui ai rien compris ou est ce qu'il y a contradiction?

Il semble donc que l'Ag T et hTERT soient suffisants pour conferer l'immortalite aux cellules. Qu'en est t'il de vTERT? Est ce qu'ils ont verifie apres infection par SV40 de ne pas avoir ajoute un vTERT?

A+

[piwi]

Je suis désolé mais j'ai en ce moment un séminaire à préparer... Meiose, histones, youpi troulala...
Pas trop la tête à faire beaucoup de rab'. J'ai quand même survolé le texte mais j'en ai pas resorti grand chose comme commantaire. J'ai quand même la même question que gorben. Pourquoi ces cellules?

Sinon je pense que tu peux quand même faire une planche avec les figures clés. Ca doit bien rentrer dans le cadre de la loi.

Je repasse dés que j'ai la tête à faire de la cancéro

[invitea0443c8c]

1/ Est ce que le choix du type cellulaire a ete dicte par un interet special, ou c'est juste deux types de cellules qu'ils avaient sous la main?

Je n'ai pas de réponse (j'ai vu Weinberg en conférence il y a une semaine et n'ai pas pensé à lui poser la question ). Je suppose que c'est en rapport avec le bon taux de transfection de ces cellules.

2/
C'est moi qui ai rien compris ou est ce qu'il y a contradiction?

Oui absolument c'est contradictoire. Je pensais développer en conclusion mais j'ai changé d'avis pour "piquer la curiosité du lecteur"
Les auteurs expliquent que ces colonies formées par les cellules possedant uniquement Ras et T sont très minoritaires (en réalité on en trouve 40 contre 160 pour les cellules double + pour Ras et hTERT) et beaucoup plus petites. Ils nous rassurent également en signalant que ces cellules sans hTERT ne forment pas de tumeurs chez la souris. Et enfin ils supposent que les clones qui apparaissent sans hTERT dans l'agar sont (je cite) "one manifestation of replicative mortality that occurs in the absence of telomere maintenance"...
En fait il a été montré en 2004 dans un journal plus modeste que la télomérase n'est pas nescessaire à l'obtention de cellules tumorales humaines et que seuls Ras et AgT suffisent (dans des cellules adrénocorticales humaines) même si les cellules rentrent rapidement en crise (et donc la tumeur ne grossit pas beaucoup). Je ne sais pas si ce papier a été remis en question ou pas.
Par contre il a ensuite été montré que l'Ag-T augmente l'activité de la télomérase ce qui pourrait également expliquer ce résultat bizaroïde (mais ce "détail" n'était pas connu lorsqu'ils ont publié le Nature).

Il semble donc que l'Ag T et hTERT soient suffisants pour conferer l'immortalite aux cellules. Qu'en est t'il de vTERT? Est ce qu'ils ont verifie apres infection par SV40 de ne pas avoir ajoute un vTERT?

A ma connaissance le SV40 a un génome circulaire, il n'a pas de télomères "donc" ne possède pas la télomérase et vTERT n'existe pas...

V.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea0443c8c]

Je voulais rajouter (mais les 5 minutes réglementaires d'édition ont été un peu courtes.... grrrrrr) qu'en ce qui concerne l'activation de la télomérase par l'Ag-T, il n'y a pas sur le northern qui teste la télomérase d'étude sur les cellules sans l'Ag-T donc on ne peut pas savoir s'il y a un allongement avec AgT seul sans hTERT... Cela aurait-été particulièrement intéressant d'avoir ce contrôle ce qui aurait en même temps permis à Weinberg de sortir un autre gros papier sur l'activation de hTERT par T

V.

[gorben]

A ma connaissance le SV40 a un génome circulaire, il n'a pas de télomères "donc" ne possède pas la télomérase et vTERT n'existe pas...

Ok, j'avais une copine qui bossait sur Marek, et justement le virus arrivait avec son propre vTR qui complementait cTR. Je pensais naivement que tous les virus oncogene avaient une telomerase.

Few more questions :

1/ Est ce qu'il y a d'autres associations bien connues d'oncogene mis a part RAS et TERT? D'autres equipes ont elles essaye la meme approche sur d'autres oncogenes?

2/ Est ce que la telomerase est toujours necessaire pour l'immortalisation?

3/ Est ce que quelqu'un a deja essaye de mettre plus de deux ou 3 oncogenes dans une cellules? Est ce que la cellule survie a un dereglement complet?

A+

[invitea0443c8c]

1/ Est ce qu'il y a d'autres associations bien connues d'oncogene mis a part RAS et TERT? D'autres equipes ont elles essaye la meme approche sur d'autres oncogenes?

En fait comme je l'ai signalé dans un de mes précédents messages il y a eu un essai non concluant en cellules humaines mais sans l'AgT. Sinon l'expérience a été réalisée dans des cellules murines NIH3T3 en 1983 (toujours par Weinberg) en utilisant Ras et soit myc soit l'Ag-T. L'expérience a donc été reproduite en 1986 en cellules humaines avec Ras et l'Ag-T mais sans succès.
Pour ce qui est des coopérations d'oncogènes, si l'on se place dans un cadre général oui bien entendu il y a de nombreux pattern d'expression/silencing entre oncogènes et suppresseurs de tumeurs dans les cancers. 90% des cancers du pancréas ont une mutation activatrice de Ras alors que pour les hémopathies malignes c'est beaucoup plus faible ou non observé. Les oncogènes et suppresseurs de tumeurs concernés sont très type cellulaire dépendant.

Ce qui est, à mon sens, fondamental dans cet article, outre le fait que la tentative a fonctionné, c’est qu’il montre bien les deux étapes majeures : l’immortalisation dans un premier temps puis la transformation tumorale proprement dite qui ne peut pas avoir lieu sans l’immortalisation. Le corolaire de tout ça étant qu’une cellule immortelle n’est pas une cellule tumorale.

2/ Est ce que la telomerase est toujours necessaire pour l'immortalisation?

A priori je dirai oui (sans bien connaitre le sujet). La télomérase doit avoir une activité, après qu'elle soit directe par surexpression ou par ajout d'un élément qui l'active (Ag-T)... Mais lorsqu'on lit le papier on voit que la surexpression est plus efficace que l’Ag-T car les cellules sans hTERT ne donnent pas de tumeurs.

3/ Est ce que quelqu'un a deja essaye de mettre plus de deux ou 3 oncogenes dans une cellules? Est ce que la cellule survie a un dereglement complet?

Je ne sais pas mais de toute façon en mettant Ag-T, Ras et h-TERT finalement on active plus de 3 voies puisque Ag-T va activer d'autres éléments.
Au niveau de la survie je dirai que les cellules cancéreuses sont par définition des cellules très dérégulées avec parfois d'innombrables remaniements mais ça fonctionne parce que l'apoptose est défectueuse, parce que la cellule répare ses télomères et by-pass les systèmes de contrôles. Si l'on s'amusait à faire un caryotype d'HeLa je suis sûr qu'on trouverait peut-être 100 ou 200 chromosomes avec des réarrangements dans tous les sens. C'est ce que l'on observe pour les sarcomes à génétique complexe. Le génome de certaines cellules tumorales n'a plus grand chose à voir avec un génome humain standard.
La cellule rebâtit ses réseaux de signalisations à partir des protéines clef endommagées. C'est d'ailleurs pour cela qu'en ciblant ces éléments on a de bonnes chance d'éliminer la cellule.

V.

[piwi]

Bonjour à tous les membres de notre forum biologie.
Nous sommes heureux de vous offrir cette nouvelle rubrique d'analyse de papiers scientifiques. Il s'agit d'un exercice classiquement proposé dans les laboratoires de recherche. Il permet d'ouvrir la curiosité, de découvrir de nouveaux aspects méthodologiques et conceptuels. Il permet aussi, et peut être surtout, de discuter et de confronter sa vision des choses.
Pour les personnes qui n'ont pas l'habitude de cela, que ce ne soit pas un frein. Cette nouvelle rubrique est l'occasion pour vous, de voir comment réfléchissent les scientifiques, quels sont leurs idées, leurs limites. N'hésitez donc pas à participer et à poser des questions.

Pour la modération,
piwi

[invite71f23525]

Bonjour,

Superbe discussion. Sans transition, je trouve que le résultat en agar mou avec les HEK transfectées avec H-Ras n'a rien de contradictoire avec le fait que H-Ras ne soit pas nécessaire pour l'immortalisation des cellules. D'une part, l'expérience en agar mou permet avant tout de voir si les cellules sont capables de proliférer malgré l'absence d'adhérence. L'immortalisation est nécessaire puisque souvent cette expérience s'étale sur 3 semaines environ mais ce n'est pas le critère mis en avant par cette méthode. D'autres part, les cellules HEK sont d'origine embryonnaire, elles appartiennent donc à des stades de différenciation peu avancés. De ce fait on a expression de la télomérase, une expression intermédiaire entre une cellule souche et une cellule différenciée, globalement. Ceci explique donc (cela ne regarde que moi ) que seules les HEK arrivent à former des colonies, à la différence des fibroblastes qui en sont incapables (puique étant des cellules différenciées) . A noter tout de même que les HEK ne forment pas de glorieuses colonies comparées à leurs consoeurs transfectées H-Ras/hTERT.

Pour la question sur la télomérase et son importance dans la formation de tumeurs. Les chiffres parlent par eux-mêmes : dans 80 à 90% des cancers on observe une expression inappropriée de la télomérase...Reste encore 10% des cancers qui ne l'expriment pas. Donc elle n'est pas indispensable mais reste un facteur très avantageux pour une cellule tumorale l'exprimant. D'ailleurs Vinc a parlé d'un article ayant montré que la télomérase n'est pas indispensable à la formation de tumeurs :

il a été montré en 2004 dans un journal plus modeste que la télomérase n'est pas nescessaire à l'obtention de cellules tumorales humaines et que seuls Ras et AgT suffisent (dans des cellules adrénocorticales humaines) même si les cellules rentrent rapidement en crise (et donc la tumeur ne grossit pas beaucoup)

L'immortalisation étant nécessaire à l'apparition de tumeurs, on peut prendre peut-être un raccourci (...) en disant que l'immortalisation peut se passer de la télomérase mais là je parcours un terrain trop inconnu...

Greg

PS : les raccourcis en bio donnent souvent lieu à des ramassages en beauté

[piwi]

Salut.
Je ne suis pas certain de la pertinence de ta remarque quant à l'origine embryonnaire des HEK (human embryonic kidney). Comme leur nom l'indique, elles dérivent de rein embryonnaire. Rien que cela indique qu'elle n'est pas si indifferenciée que cela. En fait, le développement embryonnaire n'est pas une étape de tous les possibles. Les cellules se différencient déjà largement. La nature de ces cellules reste très indécise. Fibroblaste? cellule épithéliale? endothéliale? Voir même des neurones...
Dire c'est embryonnaire, donc c'est peu différencié est un raccourci et...
...les raccourcis en bio donnent souvent lieu à des ramassages en beauté

Pour la télomérase, je pense qu'il ne faut peut être pas voir le mécanisme mais la finalité. Toute division entraine mécaniquement un raccourcissement des télomères. Il n'y a rien à faire, c'est nécessaire. Dés lors, une cellule immortelle qui n'exprime pas la télomérase a nécessairement trouvé un autre moyen de réparer ses chromosomes ou alors de survivre sans télomère (avec l'ADN circularisé). Donc oui, l'immortalisation pourrait se passer de la télomérase, mais pas d'un moyen de contourner la difficulté.

Cordialement,
piwi

[gorben]

Salut,

Je ne suis pas un habitue de la technique, mais a utiliser des retrovirus ils ne risquaient pas de "toucher" a autre chose? Des plasmides n'auraient pas ete plus adaptes?

A+

[invite71f23525]

Pour répondre à Piwi. En effet, ma réponse à ce sujet était assez abrupte. Je continue de défendre ma cause car pour moi ce n'est pas un hasard si les HEK arrivent à former des colonies avec H-Ras seul (+ Ag T) à la différence des fibroblastes. J'apporte une nuance : au sein d'un tissu embryonnaire, la probabilité de trouver des progéniteurs (je ne parle pas de cellules souches) est plus importante que dans le même tissu adulte, on est d'accord? Une lignée cellulaire étant plus ou moins hétérogène, dans la lignée HEK on a donc beaucoup de chance d'avoir affaire à un nombre non négligeable de progéniteurs rénaux au sein de la population cellulaire. Ce sont probablement ces mêmes progéniteurs qui donnent quelques colonies en agar mou, ils sont sélectionnés (involontairement) par la méthode utilisé qui nécessite un potentiel replicatif illimité, pour ne pas parler d'immortalisation. Mes dires ne sont que des hypothèses mais ça ne me semble pas si infondé que ça.

Greg