Hybridations plasmides et sondes

[Didie13]

Bonjour à tous,

Je travaille en ce moment sur le clonage et en relisant mon cours quelque chose me choque. J'ai écrit par étape:

- boite de petri avec plasmides
- réplique (nylon/ nitrocellulose)
- dénaturation plasmides à la soude
- fixation membrane (UV ou cuisson)
- hybridation plasmides
....( over night)
- lavage pour retirer dernière hybridations non spécifiques
- extraction plasmides
- séquençage

Okay...mais alors quel est l'intérêt d'être passé par des plasmides si on ne les intègre pas à des bactéries pour les cloner? (transformation)
Voilà c'est ce qui me choque dans ce procédé, il n'y a pas l'étape de transformation.
Alors est ce une erreur de ma part ou de la part du prof ou est ce réellement ça?


Sinon est ce que quelqu'un sait comment choisit-on d'utiliser des bactéries ou des phages?


Merci d'avance
Didie13
-----

[invite51b49a45]

je pense que tes plasmides étaient dans ta boite de pétri initiale dans laquelle il a aussi des bactéries sinon ca sert à rien et que ces plasmides étaient dans ces bactéries et que tu nous présente un protocole d'extraction d'ADN plasmidique.
Attention les phages sont une forme de virus bactérien (à vérifier). Il y a ici deux facon de faire. Soit on construit des plasmides "directement" que l'on peut insérer dans des bactéries via des méthodes comme l'éléctroporation. Sinon les phages: un phage est une sorte de virus bactérien, constitué donc d'une capside et d'un acide nucléique à l'intérieur. pour faire court tu construit un acide nucléique qui pourra etre ensuite encapsidé. Le phage est alors mis en présence de bactéries et il agit alors comme tout bon virus en injectant son ADN à l'intérieur de la bactérie qu"il rencontre. Il présente l'intéret d'être un système d'injection "propre" tandis que avec les plasmides c'est un peu plus délicat. Il y a aussi un choix entre les deux qui est fait fonction de la taille de ton insert, du nombre de copies que tu veux et d'autres éléments qui m'échappent à cette heure tardive. J'espère avoir pu t'aider un peu

[Didie13]

Ah ok! Merci c'était parfait! Je pense avoir bien compris cette fois

J'ai du omettre de noter qu'avec les plasmides il y avait les bactéries.

[gorben]

Salut,

- boite de petri avec plasmides
- réplique (nylon/ nitrocellulose)
- dénaturation plasmides à la soude
- fixation membrane (UV ou cuisson)
- hybridation plasmides
....( over night)
- lavage pour retirer dernière hybridations non spécifiques
- extraction plasmides
- séquençage

Tu as ici 3 manips differentes. Je vais les detailler un peu plus pour que tu comprennes :

Manip 1 : C'est en fait un Southern blot (voir ton autre post)
- Culture sur boite de petri de bacteries contenant une banque plasmidique ou un clonage divers
- réplique des colonies sur nylon ou nitrocellulose ET sur une nouvelle boite de petri
- dénaturation de l'ADN à la soude (plasmides et ADNg)
- fixation de l'ADN sur la membrane (UV ou cuisson)
- hybridation over night des plasmides par une sonde ADN specifique
- lavage pour retirer dernière hybridations non spécifiques et excés de sonde
- revelation de la sonde par chimioluminescence ou autre methode

Cette manip te permet de visulaiser quelles colonies (et donc quels plasmides) contiennent ta sequence d'interet (tu auras un spot noir sur ta photo). Ensuite, il ne te reste plus qu'à recuperer les colonies identifiées sur ta deuxieme boite de petri (identique à ta membrane de nitrocellulose puisque replique), a les relancer en milieu liquide pour en extraire l'ADN plasmidique (manip 2).
Tu vas pouvoir ensuite sequencer ton ADN plasmique, ou sous cloner si le fragment integré est trop gros pour un sequencage (manip 3).

Le reel clonage se situe en amont de la premiere manip. Il correspond en fait a une manipulation de l'ADN (en vue de l'insertion dans un plasmide par exemple). Evidemment, suite a ton clonage tu auras besoin de transformer des bacteries puis de verifier ton clonage (manip 1, 2 et 3).

Un phage est un virus specifique aux bacteries.
Je ne pense pas que tu puisses utiliser un phage à la place d'une bacterie pour faire du clonage dans la mesure ou justement, le phage necessite une bacterie pour se developper. Tu peux utiliser des phages pour faires des banques d'ADNg, parce que ces derniers ont la capacité d'integrer une grande quantité d'ADN dans leur capside, ce qui n'est pas le cas des plasmides.
En revanche, un phage n'est absolument pas plus "propre" qu'un plasmide, et je dirais meme qu'il est beaucoup plus "sale" dans la mesure ou d'une part tu ne controles pas du tout l'ADN encapsidé (à la difference du plasmide) et d'autre part, le phage est vivant par lui meme, ce qui fait que tu ne controles pas toujours à 100% son cycle...

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite51b49a45]

oui j'entendais plus propre dans la mesure ou on ne fait pas tremper les bactérie dans un milieu agressif et qui dégrade les membranes c'est tout. Et il me semble que la quantité intégrable dans un phage est assez restreinte du fait de la taille maximum d'encapsidation. Cependant les phagemides permettent quand à eux d'intégrer de plus grande quantité d'ADN (selon moi en tout cas).

[Didie13]

Manip 1 : C'est en fait un Southern blot (voir ton autre post)
- Culture sur boite de petri de bacteries contenant une banque plasmidique ou un clonage divers
- réplique des colonies sur nylon ou nitrocellulose ET sur une nouvelle boite de petri

Comment fais-tu une réplique sur une nouvelle boite de pétri? Par "buvardage" aussi?

Merci pour toutes ces précisions en tout cas gorben c'est très sympa d'avoir pris le temps de répondre.
Merci une fois de plus mikael69!

Tout est beaucoup plus clair maintenant

[gorben]

Comment fais-tu une réplique sur une nouvelle boite de pétri? Par "buvardage" aussi?

Oui exactement, tu fais ca via un velour (buvard). Generalement, tu place ton velour sur l'appareil de replication, tu appliques sur ta boite d'origine, tu passes ensuite vers ta membrane, et avec le meme velour tu finis sur une boite de petri "neuve". Utiliser le meme velour pour toutes repliques te permet de controler la qualite de ta replication.

A+

[Didie13]

ok ok! Merci pour tout!

[invitef798c617]

Oui exactement, tu fais ca via un velour (buvard). Generalement, tu place ton velour sur l'appareil de replication, tu appliques sur ta boite d'origine, tu passes ensuite vers ta membrane, et avec le meme velour tu finis sur une boite de petri "neuve". Utiliser le meme velour pour toutes repliques te permet de controler la qualite de ta replication.

A+

ah voilà enfin quelqu'un qui sait encore à quoi ressemble un velour de bactério!
probablement la tradition de ton labo de post-doc?
cheers,
Hiro