Bonsoir à tous,
J'ai vu la technique de clonage par Gateway, mais ce n'est pas clair du tout. Je ne vois pas l'intêret du passage d'un vecteur donneur, à un vecteur d'entrée, à un vecteur de destination et enfin d'expression...
Est ce que quelqu'un pourrait m'expliquer cette technique ou a un schéma?
Merci d'avance
Didie13
Voilà déjà le schéma qu'on nous propose.
http://img187.imageshack.us/img187/8...titre12pr9.jpg
Mais je ne comprends vraiment rien sur le sens des flèches et pourquoi il y a des gènes qui sont sur un vecteur et après plus....
bonsoir,Envoyé par Didie13
Bonsoir à tous,
J'ai vu la technique de clonage par Gateway, mais ce n'est pas clair du tout. Je ne vois pas l'intêret du passage d'un vecteur donneur, à un vecteur d'entrée, à un vecteur de destination et enfin d'expression...
Est ce que quelqu'un pourrait m'expliquer cette technique ou a un schéma?
Merci d'avance
Didie13
Gateway permet de réaliser en quelques minutes la construction de toute une série de plasmides apparentés,
alors qu'en général la construction de chaque plasmide séparément prend entre 2 jours et... une éternité! (= il y a des plasmides qu'on n'arrive jamais à obtenir).
bien souvent on a besoin de différents plasmides portant le même fragment d'ADN pour réaliser plusieurs manips,
par exemple:
- surproduction de protéine
- régulation génétique
- targetting
- knock-out
si la construction de chaque plasmide te prend 6 mois alors ta thèse est mal partie,
par contre si d'un coup de Gateway tu obtiens toutes les constructions en 1 semaine c'est beaucoup mieux...
l'efficacité de Gateway est basée sur l'utilisation des intégrases du genre Cre/Flp etc,
c'est un système plus efficace que l'ensemble "enzyme de restriction + ligase" pour faire passer un fragment de DNA d'un plasmide à un autre,
d'ailleurs il fonctionne en principe aussi bien in-vivo que in-vitro,
c'est au départ un système utilisé par le phage lambda, le phage P1, et la levure.
Hiro
c'est un peu mieux expliqué ici:Voilà déjà le schéma qu'on nous propose.
http://img187.imageshack.us/img187/8...titre12pr9.jpg
Mais je ne comprends vraiment rien sur le sens des flèches et pourquoi il y a des gènes qui sont sur un vecteur et après plus
http://www.bio.davidson.edu/courses/...on/gateway.htm
Hiro
Merci à toi! C'est vrai que c'est un peu plus clair! Mais concrètement j'ai l'impression de faire la cuisine quand je lis ça....
BOnjour,
je n'étais pas sur d'avoir compris l'interet des 2 vecteurs et 2 recombinaisons pour cette technologie, je me demandais pourquoi ne pas utiliser directement le vecteur d'entrée comme vecteur d'expression. ??
je pense que l'interet du vecteur donneur (qui devient vecteur d entrée après avoir récupéré le gène) est qu'il a tout les gènes permettant l'infection lambda et les gènes accompagnateurs de la recombinaison. Et le vecteur de destination (qui devient d'expression) a les gènes permettant la suexpression du gène d'intéret (promoteur inductible ou costitutif, ...)
Il n'ont pas pu mettre tout ces gènes (infection+recombinaison+suexp ression du gène d interet) dans le meme vecteur parceque ca prendrait trop de place ??? est ce que c est ca?
bon n'importe quoi y a pas d'infection phagique lambda apparemment....
qui sait pourquoi on utilise deux vecteurs alors ?
(please j'ai exam demain....)
Non en effet, il n'y a pas d'infection phagique...dans tes tubes il y a :bon n'importe quoi y a pas d'infection phagique lambda apparemment....
qui sait pourquoi on utilise deux vecteurs alors ?
(please j'ai exam demain....
- ton insert ou ton clone d'entrée
- ton plasmide de destination
- une intégrase
- du tampon et de l'eau
On passe d'abord par une première recombinaison en plasmide donneur et on obtient un clone d'entrée. Tu va pouvoir multiplier ce plasmide et en stocker une grosse partie, afin de réaliser d'autres clonages ultérieurs, dans des tas de vecteurs de destination différents. D'où l'intérêt de cette étape supplémentaire.
