ubiquitine et protéasome

[Vinc]

Je t explique la manip: Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ ? ?

A ma connaissance le mg132 s'utilise sur toutes les cellules...

Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation ?

Quelle ets la protéine que tu transfectes? c'est une E3 ou une autre protéine qui permet l'envoit de la protéine cible vers le protéasome??
Si tu mets un bloqueur il n'y aura pas dégradation! Si tu vois une accumulation avec ton vecteur et sans ton vecteur (toujours avec un bloqueur) c'est que ton vecteur ne joue pas de rôle dans la dégradation. Si tu veux voir l'ubiquitination de la protéine alor sil faut bloquer le protéasome, et tu peux utiliser la technique classique de purif (mais qui est pas évidente du tout et demande un paquet d emise au point)...

Vinc

[Vinc]

Et pour voir si la prot est ubitinylée je suppose qu il y a des encore anti-ubiquitine ?

Ca ne te donnera pas d'info car il y a un très grand nombre d eprotéines ubiquitinées : ce n'est pas spécifique de la protéine que tu étudies !

Vinc

[Znomjo]

Serait-ce possible de faire un mutant pour la protéine dont tu cherches le rôle??

[delstephie]

A ma connaissance le mg132 s'utilise sur toutes les cellules...


Quelle ets la protéine que tu transfectes? c'est une E3 ou une autre protéine qui permet l'envoit de la protéine cible vers le protéasome??
Si tu mets un bloqueur il n'y aura pas dégradation! Si tu vois une accumulation avec ton vecteur et sans ton vecteur (toujours avec un bloqueur) c'est que ton vecteur ne joue pas de rôle dans la dégradation. Si tu veux voir l'ubiquitination de la protéine alor sil faut bloquer le protéasome, et tu peux utiliser la technique classique de purif (mais qui est pas évidente du tout et demande un paquet d emise au point)...

Vinc

Ok donc je peux tenter de cotransfecter avec mon vecteur et voir ce que ca donne au niveau de l'expression de la protéine ..

[delstephie]

Ok donc je peux tenter de cotransfecter avec mon vecteur et voir ce que ca donne au niveau de l'expression de la protéine ..

Attend je comprends pas.. Tu me dis que si je transfecte avec mon vecteur + inhibiteur du protéasome et que je vois une accumulation avec et vecteur c'est qu'il n y a pas de lien avec la dégradation. Mais pourtant avec ou sans mon vecteur j aurai une accumulation vu que le protéasome est bloqué ???

[Vinc]

Enfait on s'intéresse à une protéine et apparement elle serait dégradée par cette voie mais rien ne l affirme. Pour etre amené au protéasome elle aurait besoin d'une protéine particuliere. Or cette proteine particuliere je suis entrain de la cloner afin de la surexprimer dans un modele. Et ce qui m interesse s'est de savoir s'il y a vraiment interaction entre ces deux proteines et donc si elle est degradé par la voie ubiquitine...

Tu poses deux questions différentes!
1. Y'a t-il réellement dégradation de ta protéine par le protéasome.
Pour répondre à cette question dans un premier temps, tu mets du mg132, tu regardes si il ya plus de protéine lorsque tu mets du mg132 par rapport à ton contrôle négatif où tu ne mets pas de mg132. Si ca ne fonctionne pas c'est qu'effectivement il faut que tu surexprimes ton autre protéine. A ce moment là pas de problème tu refais la manip en surexprimant (en prenant bien soin de mettre tous les contrôles nescessaires : sans Ubi, sans protéine accessoire, sans mg132, ....).

2. Y'a t-il intéraction entre ta protéine d'intérêt et la protéine accessoire sois disant nescessaire pour la dégradation? Et si oui, est ce que cette intéraction est nescessaire et suffisante pour la dégardation de ta protéine d'intérêt?

Là il faut que tu montres l'intéraction par CO-IP ou par double hybride (ou les 2 pour être sûr).
Ensuite il faut que tu mettes en place un protocolle qui permette d emontrer que sans cette intéraction ta protéine cible n'ets pas dégrader. Pour ce faire tu vas utiliser des mutants , des siRNA, etc....

Tout ça est assez compliqué pratiquement parlant et va demander beaucoup de temps, de pratique et de patience !

Envois moi un MP si tu veux parler de l'ubiquitination, c'est mon sujet de recherche et on peut éventuellement s'entraider !

A+
Vinc

[delstephie]

Tu poses deux questions différentes!
1. Y'a t-il réellement dégradation de ta protéine par le protéasome.
Pour répondre à cette question dans un premier temps, tu mets du mg132, tu regardes si il ya plus de protéine lorsque tu mets du mg132 par rapport à ton contrôle négatif où tu ne mets pas de mg132. Si ca ne fonctionne pas c'est qu'effectivement il faut que tu surexprimes ton autre protéine. A ce moment là pas de problème tu refais la manip en surexprimant (en prenant bien soin de mettre tous les contrôles nescessaires : sans Ubi, sans protéine accessoire, sans mg132, ....).

2. Y'a t-il intéraction entre ta protéine d'intérêt et la protéine accessoire sois disant nescessaire pour la dégradation? Et si oui, est ce que cette intéraction est nescessaire et suffisante pour la dégardation de ta protéine d'intérêt?

Là il faut que tu montres l'intéraction par CO-IP ou par double hybride (ou les 2 pour être sûr).
Ensuite il faut que tu mettes en place un protocolle qui permette d emontrer que sans cette intéraction ta protéine cible n'ets pas dégrader. Pour ce faire tu vas utiliser des mutants , des siRNA, etc....

Tout ça est assez compliqué pratiquement parlant et va demander beaucoup de temps, de pratique et de patience !

Envois moi un MP si tu veux parler de l'ubiquitination, c'est mon sujet de recherche et on peut éventuellement s'entraider !

A+
Vinc

OK je comprends pour montrer l'interaction je pense a faire un pull down