Citation Envoyé par Vinc Voir le message
Salut!

Tu mets un bloqueur du protéasome comme le mg132 et tu regardes l'accumulation de ta protéine par western blot.








Non il y a un protéasome dans le noyau ET dans le cytoplasme.



Non ça dépend, il n'y a pas forcément phosphorylation avant ubiquitination, ce n'est pas le cas général (c'est en particulier valable pour la béta caténine et d'autres...).



Montrer l'ubiquitination d'une protéine n'est pas une manip spécialement simple mais ce n'est pas impossible.
Personellement j'utilise un système de purification sur Nickel. Je transfecte les cellules avec l'ubiquitine taggée (car voir une ubiquitination sans transfecter l'Ubi est impossible pour la plupart des protéines). Si la protéine est connue pour être dégradée par le protéasome, il faut bien entendu ajouter un bloqueur pour la visualiser. On purifie les lysats cellulaires et on fait un western avec l'Ab correspondant à la protéine étudiée (ou contre le tag si la protéine est taggée).
C'est une manip assez longue (5 bonnes sjournées voire plus), qui demande pas mal d'habitude et de méthode pour avoir un blot relativement propre à la fin. Il faut se placer dans des conditions particulièrement stringantes pour la purification et il y a vraiment moyen de galérer....
Et la quantification des blots est souvent indispensable pour pouvoir conclure...


Tu travailles sur l'ubiquitine? Sur le protéasome? Qu'est ce que tu veux montrer exactement???

A+
Vinc

Enfait on s'intéresse à une protéine et apparement elle serait dégradée par cette voie mais rien ne l affirme. Pour etre amené au protéasome elle aurait besoin d'une protéine particuliere. Or cette proteine particuliere je suis entrain de la cloner afin de la surexprimer dans un modele. Et ce qui m interesse s'est de savoir s'il y a vraiment interaction entre ces deux proteines et donc si elle est degradé par la voie ubiquitine...

Je ne suis peut etre pas assez claire