gel shift : hhhheeeeelllp !!!!!!!

[invitec22fc3aa]

Coucou !

je suis en thèse et je travaille sur une proteine dont on voudrait confirmer l'interaction avec un promoteur d'un géne... je dois faire du gel shift mais dans mon labo on ne peut pas utiliser de radioactivité.... j'ai vu qu'il existe des kits qui ne necessitent pas de radioactivité, il y en a même un ou il n'y a meme pas besoin de marquer la sonde d'ADN, il suffit de colorer le gel apres migration avec du SYbr green et du Sypro, cela a l'air tres pratique !

mais je voudrais savoir si quelqu'un a deja uitlisé de tels kits et s'ils sont efficaces ??????
autre question: ma sonde d'ADN fait 300 pb, quelle est la meilleure façon de la marquer ?

aidez moi ! je susi en fin de thèse, hyper à la bourre et personne ne peut m'aider dans les labos que je connais !
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[gorben]

Salut,

Je te recommande le kit de Roche "DIG gel shift kit". J'ai eu a l'utiliser pendant ma these, le marquage se fait par la digoxigenine et la revelation est de type "western blot". C'est un kit clef en main, c'est a dire que tu as tous les tampons pour faire ton shift de la permiere a la derniere etape. La sensibilite est tres bonne puisque j'utilisais moins de 1 ng d'ADN pour mon shift et que c'etait tres tres bon. La manip prend une petite journee avec ce kit !

A+

PS : 300 pb c'est bien, mais pas plus parce que apres tu seras obligee de diminuer la concentration d'acrylamide de ton gel, et que la manip va devenir tres delicate

[invitec22fc3aa]

Merci pour tes conseils c tres sympa !
g qd même encore une petite question....je sais qu'il faut faire des expériences de compétition sonde chaude/sonde froide pour tester la spécificité de l'interaction ADN/prot..... s'il y a des aspécificités, est-ce dû au marquage de la sonde ?
je pose cette question car dans le cas de l'utilisation du kit dont je parlais la derneiere fois, on ne peut pas réaliser d'expérineces de compétition car c le gel qui est coloré apres l'electrophorese et il n'y a pas de marquage de sonde d'ADN, donc je ne vois pas pourquoi l'interaction ADN/prot serait non spécifique dans ce cas......
je sais....ma question n'est peut être pas tres claire mais bon, si tu peux m'éclairer sur ce point ce serait cool !

Merci encore !