bonjour,
j'ai des caryotypes à réaliser mais je n'ai pas de protocole bien clair.
est-ce que quelqu'un aurai un protocole clair et qui marche. une autre question, est-ce qu'il faut ajouter du milieu de montage et peut on mettre du dapi.
merci et bonne soirée
j'ai pas de protocole mais il y en a sur internet comme là
http://www.riedlab.nci.nih.gov/publi...Prep_Human.pdf
Par contre, je peux répondre à ta 2ème question. Le DAPI est une contre coloration fluorescente donc c'est bien pour la FISH mais pour un caryotype, c'est pas top. Mieux vaut faire les techniques standard R et G, si possible avec synchro et BRdU
Re : caryotype
merci, mais je ne pense pas que ce protocole sert à voir les bandes G. je pense qu'il faut se servir de Giemsa.
j'ai essayé un protocole hier mais rien vu!!!
d'autres idées? SVP
Bonjour,
Voici le protocole utilisé en TP de Marqueurs moléculaires et techniques biologiques pour réaliser un caryotype sur des cellules de souris :
Je ne sais pas si tu cherches tout ça, ou juste pour le banding..
Jour 1) Injection sous cutanée de solution de levure de boulangerie (je croyais qu'on disait levure de boulanger mais bon..) préparée 30 min avant :
0,5g de levure
1,1g de glucose
5ml d'eau distillée
==> 0,02ml par gramme de souris
Jour 2) Injection de Velbé par voie intrapéritonéale
==> 0,01ml par gramme de souris
==> Incubation à 37°C de 8ml de KCl à 0,075M.
==> euthanasie de la souris 3/4 d'heure après
- faire tomber la moëlle osseuse des os dans un tube grâce à des injections de KCl à l'intérieur des os de la cuisse.
- incubation 20min à 37°C
ajout de 2ml de fixateur (1 volume d'acide acétique glacial + 3 volumes d'éthanol) et homogénéïser à la seringue (en aspirant/refoulant).
- centrifugez 3 fois de suite à 1200 tours pendant 10min, en prélevant le surnageant entre chaque centrifugation puis en remettant 6ml de fixateur.
- à la dernière centrifugation, n'ajoutez que 0,5ml de fixateur.
- sortez une lame du congélateur à -20°C et étalez 4 gouttes d'extrait dessus et sècher à la lampe à alcool.
- déposer la lame sur une platine chauffante à 40°C
Jour 3)
- préparez un bain marie à 60°C et y déposer un tube Borel rempli de la solution 2xSSC.
Compo pour 1L
...0,3 M NaCl (soit 17,53g)
...0,003 M Trisodium citrate 2H20 (soit 8,82g)
...qsp Eau distillée
...ajuster à pH 7 avec de la soude
- vérifier la température du tube Borel avec un thermomètre. Quand la solution atteind 60°C, plongez la lame encore chaude pendant 1h dans le bain marie.
- préparation de la trypsine :
... 250ml d'eau distillée au frigo
... 500ml d'une solution saline (sérum physio) : NaCl à 8,5%o au frigo pendant 20min
... 125mg de trypsine dissout dans 50ml de solution saline
... ajuster à pH 7
... la solution obtenue doit être utilisée à 11-12°C.
- au bout d'1/2h de bain marie, sortez la lame et rincez là doucement sous l'eau du robinet puis sous un jet d'eau distillée.
- laissez sècher la lame verticalement contre une support.
- préparez 3 nouveaux Borel :
..... 1. avec la solution saline
..... 2. avec la solution de trypsine
..... 3. avec de l'eau distillée
Humidifiez la lame dans 1., trempez là dans 2. pendant 1min15sec, rincez rapidement dans 3., puis sous un jet d'eau distillée.
Laissez sécher.
Préparez un Borel de Giemsa 5% (qui doit rester à l'obscurité). Enlevez la pellicule de cette solution en y plongeant successivement 2 lames vierges.
Trempez la lame avec l'extrait 5 à 10min (on l'a fait 7min).
Rincez à l'eau du robinet puis à la pissette d'eau distillée.
Sèchez puis observez.
Le protocole que je t'ai mis en lien nécessite une culture de 72h donc si tu as le résultat hier, c'est qu'il y a un problème.Envoyé par pticoeur
merci, mais je ne pense pas que ce protocole sert à voir les bandes G. je pense qu'il faut se servir de Giemsa.
j'ai essayé un protocole hier mais rien vu!!!
d'autres idées? SVP
Mais effectivement, ça doit pas être des bandes G car ça nécessiterait une phase de digestion par la trypsine, ce qui est absent du protocole.
J'ai trouvé ça,
http://www.jax.org/cyto/gcbands.html
mais ça nécessite d'avoir déjà des lames avec des métaphases dessus. Tu peux imo te servir du premier protocole.
Merci pour vos conseils et protocoles.
je vais essayer.
pour te répondre Bohr, oui j'ai déja des lames avec des métaphases dessus.
désolé pour la faute Borh!!! faute de frappe.
