Viabilité d'une bactérie et ARN

[invitedfe00c9c]

Salut, je suis tombée sur ce forum en cherchant des solutions à mes problèmes d'extraction d'ARN.
En fait, j'ai appliqué le protocole cité par yoyo (merci ) et j'ai fait une migration sur gel d'agarose du meme échantillon avant et après l'inactivation de la DNase c'est à dire les 5 min à 90°C
avant: une bande bien nette
après: une tache (smear)
c'est déjà là un premier problème et le deuxième : j'ai fait une TR (avec une amorce oligodT) et j'ai pas obtenu d'ADNc, serait-il possible que mes ARN soient désaltérés par la première étape de la TR (92°C - 2 min)??
voilà pour le moment, mercii
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[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Pour l'étape à la DNase, plusieurs possibilités :

- La DNase n'est pas RNase-free, c'est à dire qu'elle est contaminée par des RNases qui dégradent les ARNs. Sur le lot de DNase, il faut qu'il y ait la mention "RNase-free", c'est très important.
- Le smear d'ADN génomique dégradé masque la bande d'ARN (tout dépend de son intensité dans la condition sans DNase). Tu peux essayer de colorer à l'acridine orange qui colore spécifiquement les ARNs, ainsi ils pourront éventuellement se démarquer du smear si le problème vient de ce point là. Tu peux aussi essayer d'incuber un peu plus avec la DNase afin que le smear soit moins étendu et déplacé vers le bas du gel (du fait qu'il y ait plus de dégradation donc plus de fragments de faible taille).

Une question aurait dû me venir plus tôt : tu ne passes pas par une étape te permettant de te débarrasser de l'ADN, du genre colonne ou extraction phénol/chloroforme?

Pour le deuxième problème (RT et non pas TR ), avant tout, as-tu réaliser la RT avec les ARNs incubés avec la DNase? Si oui, je dirais qu'il n'y a presque pas à aller chercher plus loin : la DNase utilisée est contaminée par des activités RNasiques.
L'étape à 92°C ne désaltère pas les ARNs (moi je fais 85°C 5 minutes, je ne pense pas que ça y change grand chose).

Greg

[Flyingbike]

en absence de RNase, les ARN sont stables même a haute température. Pour faire une RT tu es obligée de dénaturer a 92 ou 95 donc si tes ARN se dégradent ce moment là c'est qu'il y a un problème. Il existe des produits pour protéger les ARN pendant les RT notemment, mais c'est cher : RNasin de Promega, RNAse out de chez invitrogen par exemple.

[Yoyo]

Salut

Non les ARN ne sont pas stables a hautes températures, meme a température ambiante ou à -20 il y a une autolyse des ARN. C'est une molécule tres instable, il est normal qu'elle ne resiste pas a des incubations prolongées a 92 ou 95°C.

Les produits que tu cites ne sont que des inhibiteurs de RNAses.

YOyo

[Flyingbike]

a mon avis l'essentiel de la dégradation des ARN c'est les RNases. Lorsqu'ils sont propres, mes ARN peuvent rester 10 min a 95 ou 20 min a 65 ou meme une journée a room temp sans problèmes. Vu que les RNases sont plus actives lorsque la température augmente, je propose donc ces inhibiteurs de RNase. Quel est l'autre solution?

[LXR]

Si les ARNs ont été traités avec la DNase, l'autre solution peut être d'opter pour une DNase qui est bien RNase free.

Greg

[invite765432345678]

>Meningo.

Ah oui je vois le probleme sinon j'aimerai nuancer ce que je disais car je viens de penser a un truc. Si dans ta technique d'extraction tu as un moyen d'isoler specifiquement les ARNr néosynthétisé (et pas ceux qui sont deja engagés dans le ribosome) alors tu devrais pouvoir dire que tes cellules transcrivent toujours leur ARNr.

>Clr
La RT-PCR correspond a une PCR qui a été précédée d'une étape de rétro-transcription (ARN ->ADNc). cela permet d'amplifier les ARN.

Yoyo

Bonjour,

Une question de Candide: qu'appelle t-on ARNr et ARNm. Je connais simplement l'ARN (acide ribonucléique ?).

Merci.

[Flyingbike]

l'ARNr = ribosomal, c'est un acide nucléique qui compose, avec des protéines, les ribosomes

ARNm = messager, ces ARNm contiennent (pour la plupart) une région codant une protéine

[LXR]

ARNr : ARN ribosomique, qui constitue le ribosome.

ARNm : ARN messager qui est l'intermédiaire entre le gène et la protéine. Sa lecture par le ribosome permet sa traduction en protéine.

Greg

Edit : Deux réponses valent mieux qu'une.

[invitedfe00c9c]

Re salut et merci tous

plusieurs possibilités :

- La DNase n'est pas RNase-free, c'est à dire qu'elle est contaminée par des RNases qui dégradent les ARNs. Sur le lot de DNase, il faut qu'il y ait la mention "RNase-free", c'est très important.
- Le smear d'ADN génomique dégradé masque la bande d'ARN

c'était la DNase I d'invitrogen, oui effectivement je pense pas qu'elle soit RNase-free. voilà la photo, c'est plus parlant

Une question aurait dû me venir plus tôt : tu ne passes pas par une étape te permettant de te débarrasser de l'ADN, du genre colonne ou extraction phénol/chloroforme?

je fais l'extraction au trizol sans passer par la colonne. J'ai douté de la contamination suite à la mesure de la DO. J'ai commencé par la DNase et je suis tentée par la purification de mes ARN depuis le gel (par le clean up)
J'ai de mauvais souvenirs avec un kit à colonne, c'est pour cette raison que je n'en ai pas utilisé. déjà, il s'agit d'une faible quantité d'ARN et je veux pas prendre le risque d'en perdre encore en ajoutant une élution sur colonne suite à l'extraction au trizol , un conseil?

Pour le deuxième problème (RT et non pas TR ), avant tout, as-tu réaliser la RT avec les ARNs incubés avec la DNase? Si oui, je dirais qu'il n'y a presque pas à aller chercher plus loin : la DNase utilisée est contaminée par des activités RNasiques.
L'étape à 92°C ne désaltère pas les ARNs (moi je fais 85°C 5 minutes, je ne pense pas que ça y change grand chose).

Greg

non les ARN pour RT n'étaient pas traités à la DNase et pour prévenir, j'utilise l'RNase OUT dans le milieu réactionnel en cas d'une quelconque présence d' RNase

[LXR]

Je suis désolé mais je ne comprends rien au gel. Quelle est l'échelle des marqueurs de taille? A combien se situe la bande? Les extractions d'ARNs se font-elles dans des conditions où tu surexprimes un gène pour avoir une bande majoritaire comme cela est le cas dans la piste a?

J'ai douté de la contamination suite à la mesure de la DO

Pourquoi? La mesure de la DO "classique", à 260 nm, ne permet pas de faire la discrimination entre ADN et ARN, les deux absorbant à 260 nm. Les protéines absorbent à 280 nm, certains sels ainsi que le phénol absorbent à 230 nm.

purification de mes ARN depuis le gel (par le clean up)

Ce n'est peut-être pas le cas de toutes les extractions depuis un gel, mais j'en ai fais l'expérience et il y a beaucoup de perte.

Normalement, l'extraction au trizol permet de se débarasser de la majorité de l'ADN.

déjà, il s'agit d'une faible quantité d'ARN

C'est à dire?

Greg

PS : pour mieux t'aider, le mieux est que tu nous décrive toute la manip, sans négliger les précisions pour l'étape d'extraction et post-extraction.

[Yoyo]

salut
tes echantillons a et b ont été incubés le meme temps?

Si ta DNase etait contaminé tu auras aussi une forte dégradation dans ton puit a.
Les RNase sont vraiment des enzymes super actives.

Il faut noter que s'il n'est pas spécifié que ta DNAse est RNAse free alors c'est qu'elle ne l'est pas (la derniere est beaucoup plus chere).

YOyo

[invitedfe00c9c]

mea culpa, j'ai pas voulu encombrer les messages et du coup je suis tombée dans le flou

Quelle est l'échelle des marqueurs de taille? A combien se situe la bande? Les extractions d'ARNs se font-elles dans des conditions où tu surexprimes un gène pour avoir une bande majoritaire comme cela est le cas dans la piste a?

c'est tout simplement un checking, rien n'est surexprimé, je prend 5 µl du produit de l'extraction au trizol+ bromure de bromophénol et je dépose sur gel d'agarose 1% (+BET)
La bande la plus intense sur la piste du marqueur correspond à 500pb.
je voulais juste voir ce qui ce passe avec l'ARN après les 5 min à 90 C

Pourquoi? La mesure de la DO "classique", à 260 nm, ne permet pas de faire la discrimination entre ADN et ARN, les deux absorbant à 260 nm. Les protéines absorbent à 280 nm, certains sels ainsi que le phénol absorbent à 230 nm.

en mesurant la DO, j'ai aussi les concentrations en acides nucléiques qui s'affichent, pour quelques échantillons je trouve des chiffres "exagérés" j'ai donc supposé une présence d'ADN (déduction hâtive??)

"déjà, il s'agit d'une faible quantité d'ARN "

C'est à dire?

je pars d'un échantillon de tissu (des fragments d'intestins d'insecte) minuscule (moins que 100 mg) et pas vraiment "propre" (débrits cellulaires, sang, protéines,...). à la fin de la manip, j'ai trop peu (ou pas) de produit visible au fond du tube (après la dernière centrifugation du protocole, on a théoriquement un culot d'ARN qu'on redissout dans de l'eau), les concentrations lues par le spectro sont, pour la plupart, faibles et les bandes observées sur les gels de cheking à peine visibles

PS : pour mieux t'aider, le mieux est que tu nous décrive toute la manip, sans négliger les précisions pour l'étape d'extraction et post-extraction.

je dois préciser que je me soucie de la qualité des ARN car je vais les utiliser pour une real time RT-PCR. mais d'abord, je dois réussir des essais de RT-PCR (en deux étapes) avant de m'aventurer avec la real time. et comme ça se voit, je n'ai pas encore de garantie pour la pureté de l'ARN ni sur sa qualité (puisque j'ai pas eu d'ADNc avec l'amorce oligodT, je pense pas que ce soit une faute de manipulation ou dans le protocole car les témoins positif et négatif ont donné le résultat attendu)

Pour l'extraction, j'applique le protocole fourni avec le flacon du trizolreagent en partant d'échantillons biologiques frais.
brièvement:
- broyage dans le trizol, incubation
- ajout de chloroform, agitation, incubation
- centrifugation 12 000g qui sépare le mélange en 3 phases. la phase supérieure contient l'ARN. elle est donc récupérée dans un nouveau tube
- ajout de l'isopropanol au surnagent récupéré, incubation et centrifugation. l'ARN est précipité
- lavage à l'ethanol 75%
et il ne reste que laisser sécher les culots d'ARN puis les resuspendre dans 50µl d'eau RNase-free
j'ai conservé mes ARN à -80 C pendant environ 4 mois avant de procéder à la RT. j'ai fait un checking sur gel d'agarose (j'en parlais un peu plus haut) pour les ARN et pour les produits de la RT. j'avais des bandes visibles avec les ARN mais pas pour les présumés ADNc. donc là, soit l'ARN est abimé, soit ... je ne sais quoi


voilà donc toute l'histoire

[invitedfe00c9c]

salut
tes echantillons a et b ont été incubés le meme temps?

C'est pratiquement le même échantillon, je l'ai incubé avec la DNase à 37 C pendant 15 min, puis je l'ai divisé en deux tubes a et b, seul le b était chauffé à 90 C
je suis revenu à la fiche de la DNase et rien n'indique qu'elle est RNase-free (le puit a est intact pourtant )

[Flyingbike]

c'est tout simplement un checking, rien n'est surexprimé, je prend 5 µl du produit de l'extraction au trizol+ bromure de bromophénol et je dépose sur gel d'agarose 1% (+BET)
La bande la plus intense sur la piste du marqueur correspond à 500pb.
je voulais juste voir ce qui ce passe avec l'ARN après les 5 min à 90 C
ton profil est bizarre dans la mesure ou on ne voit qu'une bande au lieu des 2 habituelles


en mesurant la DO, j'ai aussi les concentrations en acides nucléiques qui s'affichent, pour quelques échantillons je trouve des chiffres "exagérés" j'ai donc supposé une présence d'ADN (déduction hâtive??)

en DO il n'y a aucun moyen de savoir, mais si tu as 10 fois plus que prévu c'est sur que c'est suspect... en tout cas le trizol n'est pas le meilleur pour éviter l'ADN...


je pars d'un échantillon de tissu (des fragments d'intestins d'insecte) minuscule (moins que 100 mg) et pas vraiment "propre" (débrits cellulaires, sang, protéines,...). à la fin de la manip, j'ai trop peu (ou pas) de produit visible au fond du tube (après la dernière centrifugation du protocole, on a théoriquement un culot d'ARN qu'on redissout dans de l'eau), les concentrations lues par le spectro sont, pour la plupart, faibles et les bandes observées sur les gels de cheking à peine visibles

tu n'as pas besoin de beaucoup pour faire une RT qPCR, mais il ne faut pas s'attendre a voir toujours un culot, meme si c'est plus confortable de le voir...



Pour l'extraction, j'applique le protocole fourni avec le flacon du trizolreagent en partant d'échantillons biologiques frais.
brièvement:
- broyage dans le trizol, incubation
- ajout de chloroform, agitation, incubation
- centrifugation 12 000g qui sépare le mélange en 3 phases. la phase supérieure contient l'ARN. elle est donc récupérée dans un nouveau tube
- ajout de l'isopropanol au surnagent récupéré, incubation et centrifugation. l'ARN est précipité
- lavage à l'ethanol 75%
et il ne reste que laisser sécher les culots d'ARN puis les resuspendre dans 50µl d'eau RNase-free

surtout reste bien dans la glace pour les 4 premiers points

j'ai conservé mes ARN à -80 C pendant environ 4 mois avant de procéder à la RT. j'ai fait un checking sur gel d'agarose (j'en parlais un peu plus haut) pour les ARN et pour les produits de la RT. j'avais des bandes visibles avec les ARN mais pas pour les présumés ADNc. donc là, soit l'ARN est abimé, soit ... je ne sais quoi


si tu vois les 18 et 28s avant la RT, il n'y a pas de raison que la RT ne fonctionne pas si ton protocole est le bon... a moins que tu ne traines des RNases qui sont activées lors du chauffage....


pourquoi tenir absolument a une étape DNase ? il est beaucoup plus simple par exemple de choisir des amorces de PCR "a cheval" entre deux exons, comme ca tu es sure d'amplifier de l'ADNc et pas du génomique.

[LXR]

pourquoi tenir absolument a une étape DNase ? il est beaucoup plus simple par exemple de choisir des amorces de PCR "a cheval" entre deux exons, comme ca tu es sure d'amplifier de l'ADNc et pas du génomique.

+1.

Les temps de polymérisation en qPCR sont trop court pour pouvoir amplifier un intron souvent supérieur à 1 kb. En procédant comme dit Flyingbike, tu n'auras pas de problème a priori. Une faible quantité d'ADNc est suffisante pour la qPCR donc à ta place je tenterais le coup en faisant une petite qPCR de tes ADNc en prenant des amorces ciblant un gène bien exprimé comme l'ARN 18S. Si le Ct sort tard (au-dessus de 25 cycles pour ce gène cela me parait déjà tard), alors tu pourras déduire que ta quantité d'ADNc est insuffisante.

Greg

[doubleD]

Salut

Moi après la reprise de mes ARN, je rajoute une étape de purification au LiCl. C'est assez efficace et ça donne ensuite de très beaux profils au nanodrop. Pas de problèmes ensuite en RT.


Par contre j'ai un doute en lisant ce que tu écris. Ton oligodT, c'était pas pour faire des cDNA sur des ARNr au moins ?

[invitedfe00c9c]

Bonjour

ton profil est bizarre dans la mesure ou on ne voit qu'une bande au lieu des 2 habituelles

oui exactement, c'est le cas après la congélation à -80° (j'ai deux bandes 18s et 28s pour des échantillons testés immédiatement), c'est pourquoi j'étais convaincue que c'était de l'ADN et j'ai fait l'essai avec la DNase. mais bon, la bande est toujours là, y aurait une explication??

tu n'as pas besoin de beaucoup pour faire une RT qPCR, mais il ne faut pas s'attendre a voir toujours un culot, meme si c'est plus confortable de le voir...

"pas besoin de beaucoup" c'est combien de ng/µl?

surtout reste bien dans la glace pour les 4 premiers points

c'est noté

si tu vois les 18 et 28s avant la RT, il n'y a pas de raison que la RT ne fonctionne pas si ton protocole est le bon... a moins que tu ne traines des RNases qui sont activées lors du chauffage....

tous les puits du checking sont identiques au puits a, même taille et presque la même intensité, ce qui installe le doute

pourquoi tenir absolument a une étape DNase ? il est beaucoup plus simple par exemple de choisir des amorces de PCR "a cheval" entre deux exons, comme ca tu es sure d'amplifier de l'ADNc et pas du génomique.

bonne idée (je me sens si novice)

à ta place je tenterais le coup en faisant une petite qPCR de tes ADNc en prenant des amorces ciblant un gène bien exprimé comme l'ARN 18S. Si le Ct sort tard (au-dessus de 25 cycles pour ce gène cela me parait déjà tard), alors tu pourras déduire que ta quantité d'ADNc est insuffisante.

ça me parait faisable



merci beaucoup Flyingbike et Greg

[invitedfe00c9c]

Salut
Par contre j'ai un doute en lisant ce que tu écris. Ton oligodT, c'était pas pour faire des cDNA sur des ARNr au moins ?

bonjour, euuh plutot des ARNm

[invitedfe00c9c]

Moi après la reprise de mes ARN, je rajoute une étape de purification au LiCl.

tu peux être plus précis stp? tu précipites l'ADN puis tu fais comment pour isoler l'ARN?

[doubleD]

En fait le LiCl est censé précipiter spécifiquement l'ARN. Donc tout le début du protocole, c'est extraction Trizol classique.

Puis tu rajoutes un volume de LiCl 7,5 M à un volume dARN repris dans l'eau nucléase free.

Précipitation 30mn minimum. Tu récupères le culot, lavage éthanol 70%, tu reprends dans de l'eau et ils sont parfait.

[Flyingbike]

"pas besoin de beaucoup" c'est combien de ng/µl?

ben ça dépend, moi je mets 6,25ng d'ADNc dans la réaction de PCRq !

[gorben]

Salut,

Comme l'a dit Yoyo, les ARNr sont degtrades par la chaleur. Normalement l'etape de denaturation avant RT se fait a 65 deg, c'est justement pour eviter de les degrader. Va faire un petit tour sur punmed, tu trouvera pleins d'articles sur la stabilite des ARN (et surtout des ARNr) a haute temperature. Il y a meme des protocoles d'extraction d'ARN qui se font avec une etape de lyse 10' a 99 deg pour justement "purifier" ta prep des ARNr.

La DNase n'est pas en cause la dedans . Pour enlever ta DNase, il te faut utiliser un kit (ambion en fait de tres bien) ou faire une extraction phenol/chlo.

A+

[invitedfe00c9c]

Salut, je vois plus clair maintenant, je vais me réinstaller sur paillasse et je vais voir ce que ça va donner
merciiiiiiii beaucoup
à+

[Oli64200]

si je comprends bien, appliqué à un vaccin Covid, qui resterait au soleil (donc ca monte vite à 41° ), cela détruirait il les ARN cela crée une autolyse?
quelle est la T°C critique de fonctionnement (approximativement)

"Non les ARN ne sont pas stables a hautes températures, meme a température ambiante ou à -20 il y a une autolyse des ARN. C'est une molécule tres instable, il est normal qu'elle ne resiste pas a des incubations prolongées a 92 ou 95°C.

Les produits que tu cites ne sont que des inhibiteurs de RNAses.

MERCI