[biologie moléculaire] PCR à partir d'ADN génomique

[Vi95]

Bonjour à tous.
Voila je cherche à amplifier un gène à partir d'ADN génomique humain mais je ne sais pas trop de quelle quantité d'ADN partir... quelqu'un peut-il m'aider?
Merci d'avance!

[eltyranos77]

Bonjour Vi95!

Il est difficile de répondre à ta question, en effet tout dépend des primers que tu utilises, des kits PCR que tu utilises, et du nombre de cycle que tu compte effectuer avec ton échantillon. Normalement tu dois recevoir un protocole PCR spécifique au kit, voire au primer...

[piwi]

J'imagine que 100ng devraient être largement suffisants sur 30 cycles.
Maintenant c'est vrai que je ne mesure pas la quantité d'ADN (de souris) que je mets dans mes PCR.
Mais juste à titre indicatif il m'arrive de faire des PCR à partir de plasmides de 4-5kb. Pour avoir une bande à 20 cycles je prends 1ng voir moins que je mets dans 50µl de réaction.
Pour mes PCR de génotypage de routine je prends une tête d'épingle de tissu. J'en extrais l'ADN que je reprends dans 300µl. Je mets alors 1µl pour 25µl de réaction.

Cordialement,
piwi

[Vi95]

Salut!
merci pour l'aide!! En fait vu que je suis assez limitée en matériel (ADN extrait d'échantillons de tumeurs humaines) j'étais parti avec 5-10ng lors de mes premiers essais mais sans résultat. Je me disais donc que c'était peut-etre parce que ma quantité d'ADN de départ était insuffisante car visiblement quand il s'agit d'ADN génomique il faut un petit peu plus forcer la dose et j'avais l'intention de réessayer avec 100ng donc piwi tu me confortes dans mon idée!

[wishangel]

Salut a toi,
perso je travail sur du génomique de bactérie alors je sais pas si on peut faire l'équivalence. Dans mon cas, à partir de 50ng je peux avoir une amplif et Avec 100 j'assure. Si tu as un doute tu peux toujours te faire une petite gamme...

[Annaick_R]

Bonjour,

si tu es limité par la quantité d'ADN, tu peux aussi augmenter la quantité d'amorces et augmenter le nombre de cycles (n= 35 à 40).

As-tu vérifié la séquence de tes amorces ? Elles marchent sur le gène cloné dans un plasmide par exemple ?

Il arrive que des sites d'hybridation aspécifique trop nombreux perturbent la PCR (l'ADN génomique est une matrice plus complexe qu'un gène cloné dans un plasmide)

Annaïck

[Vi95]

Et bien non justement je ne sais pas si je peux faire confiance à mes amorces et je ne peux pas les tester sur la meme séquence clonée dans un plasmide parce que je ne l'ai pas et que le labo ou je me trouve n'est pas très bio mol à l'origine! Par contre j'ai repris les séquences d'amorces utilisées dans une publi donc normalement elles sont bonnes...... Sinon j'ai essayé avec 50 et 100 ng et toujours rien.... donc effectivement je doute de plus en plus de mes amorces..... mais comment vérifier sans plasmide tout est là.....