Comment analyser les résultats de PCR quantitative???

[Moumoutte]

Bonjour,

effectivement, il semblerait que tu fasses quelques confusions sur le sujet.
Si tu parles de quantification relative, tu n'as normalement pas besoin de courbe standard (nécessaire à la quantification absolue par contre).
Tu compares juste tes échantillons entre eux avec pour conclusion quelque chose du genre "la concentration en ADN de tel échantillon est 10 fois plus élevée que dans celui-ci"
Pour cela il est vrai que tu utilises des formules barbares avec des delta Ct (DCt)

Pour faire de la quantification relative, il est nécessaire de définir un gène cible qui servira de contrôle endogène.
En quantité constante dans tous les échantillons, il normalisera les biais d'extraction ou de contamination et les variations d'efficacité éventuelles de la transcription inverse. Il donnera ainsi en quelque sorte une image de la quantité de matrice apporté (ADNc).
Le DCt correspond à la différence entre le Ct du gène cible et celui du contrôle endogène.
C'est la normalisation par rapport au contrôle endogène.

Je ne suis pas un spécialiste du sujet mais j'espère que ça t'aura aider

Cordialement

[piwi]

J'ai fais un cours sur le principe de la qPCR, la méthode d'analyse que nous utilisons au labo et une méthode de choix des oligos.
Est ce que le powerpoint vous intéresse?

Je m'avance peut être un peu, je ne sais pas on peut mettre un powerpoint en ligne. Peut être en le passant au format pdf.

[LXR]

Moi ça 'intéresse, c'est toujours bien de savoir comment les autres labos s'y prennent avec une technique aussi controversée du point de vue de l'utilisation que chacun en fait : certains font systématiquement un gel d'agarose pour controler la taille du produit et la formation de dimères de primers, d'autres se servent carrément de l'ADNc du gène d'intérêt (labo à gros moyen de type HHMI) pour valider les primers,... En tout cas, pour des gènes qui sortent tard, j'ai toujours pas trouver de solution pour améliorer les courbes de fusion, malgré la validation des primers dans une lignée où ces mêmes gènes étaient bien exprimés. Je considère donc que mes résultats sont valides, malgré de bien piètres courbes de fusion dans la lignée où ils sont faiblement exprimés, mais des résultats correctement reproductibles.

Greg

[piwi]

Je pensais avoir le .ppt chez moi mais finalement je ne l'ai qu'au labo. Il faudra donc attendre lundi avant que je n'essaie de vous le mettre sur le forum au format .pdf

Cordialement,
piwi

[myriam36]

Salut

Il faut que je fasse une présentation sur la quantification relative de la PCR temps réel pour présenter mon projet de master. Je n'ai jamais fait cette expérience.
J'ai compris pourquoi il faut un gène de référence et je pense avoir compris ce que c'est le delta delta Ct mais je ne comprend pas la formule 2(exposant)ddCt
la valeur que nous donne l'ordinateur, c la ddCt, il faut l'appliquer à cette formule pour avoir la quantité d'ARN, on en fait koi ?
J'avoue que je suis perdue et tout ce kil ya sur internet n'est pas assez clair surtout que c'est en anglais.
Quelqu'un pourrait il me l'expliquer ???

[piwi]

Voici la cours que j'ai donné.

Cordialement,
piwi

[SanderGFP]

Salut,
Une question sur l'analyse des PCR quantitative "relative". Pour reprendre les termes lus sur un autre topic, c'est

estimer des variations d'un messager d'interet par rapport a un messager qui n'est pas cense varier au cours de l'experience

La formule que j'utilise dans mon fichier excel est 2^(variation du gene d'intérêt) / 2^(variation du gene référence).

Mon gène de référence est la tubuline. En général, je n'ai effectivement pas de variation de ce messager d'une condition à l'autre. Par contre, il m'arrive d'avoir des niveaux de tubuline différents d'une série de manip à l'autre, mais ce n'est pas grave tant que je compare des conditions qui partagent le même niveau de tubuline.

Ma question c'est: existe-t-il une méthode pour estimer des variations d'un messager... quand le messager référence se met à varier. Par exemple si je décide d'analyser des manips différentes où je n'ai pas eu le même taux de tubuline.

[LXR]

Du moment que le gène de référence ne varie pas entre les différentes conditions testées pour une manip donnée, il n'y a aucun inconvénient à comparer différentes manips entre elles. Ce que tu compareras sera les valeurs de ton gène d'intérêt normalisées par le gène de référence. Cette normalisation permet d'avoir un résultat comparable avec des manips faites antérieurement ou qui seront faites plus tard puisqu'elles affranchissent ta valeur d'intérêt de variations contaminantes.

Greg

[SanderGFP]

Soit ! Mais n'existe-t-il donc aucune méthode mathématique pour réajuster le taux de tubuline afin que je puisse comparer des conditions par rapport à un contrôle qui jusque là n'étaient pas comparables à cause de différence de niveau de tubuline "artéfactuelles" ?

J'y ai réfléchi depuis, et je me suis dit que si je faisais une gamme étalon de toutes les conditions contrôles que j'ai eu jusque là (je ferais un graphique : taux du messager d'intérêt par rapport au taux de tubuline de mes situations contrôles), je pourrais alors comparer toutes mes situations expérimentales par rapport à une situation contrôle extrapolée par ce graphique.

Mais bon... Ca ne marche pas. La courbe que j'obtiens n'a aucune forme mathématique particulière. Soit parce que je n'ai pas assez de valeurs (je vais essayer d'en collecter d'autres auprès de ma maître de stage), soit parce que j'ai inclus des valeurs d'expériences ratées, soit parce qu'il n'y a véritablement aucune relation mathématique qui lie la quantité de messager d'intérêt à ma tubuline dans les mêmes situations contrôles.

[kamor]

Bonjour, j'ai également un problème pour analyser des résultats en PCR temps réel Sybr Green.
Je viens de faire ma première PCR sur des échantillons avec une melt curve pour vérifier la spécificité de l'amplification. Mon problème est avec le seuil du melt peak car je n'arrive pas à comprendre ni à trouver sa signification dans l'analyse. J'ai des puits qui sont en dessous de ce seuil mais qui ont une courbe d'ampli normale, un seul pic au bon Tm. Que dois je en déduire?
Merci d'avance pour vos réponses

[LXR]

Bonjour,

Je ne comprends pas trop votre problème. Pourriez-vous joindre une image de votre courbe de fusion? D'après ce que je comprend, la valeur finale de fluorescence de vos puits ne dépasse pas la valeur seuil? Il n'y a donc pas de Ct? Votre qPCR est programmé pour combien de cycles? Car ce qui est surprenant c'est d'avoir une belle courbe de fusion tout en ayant un gène trop faiblement exprimé pour dépasser la valeur seuil. Habituellement dans ces cas là, la courbe de fusion est très évasée, très irrégulière, d'après mon expérience personnelle. Mon doute repose donc sur le nombre de cycle que vous avez programmé. Sur l'appareil que j'utilise, 40 cycles sont effectués. Toutefois pour des gènes sortant à 30-35 cycles, je me méfie d'autant plus que le Ct se rapproche de 35, au-delà de 35 cycles je considère que le gène n'est pas exprimé.

Greg

[piwi]

au-delà de 35 cycles je considère que le gène n'est pas exprimé.

Ca me semble drastique!
Au delà de 25 cycles on considère que la PCR est mois robuste (c'est à dire que l'on peut commencer à voir les effets de la dégradation de la TAQ, de son inhibition par les produits de la PCR etc...) C'est pourquoi il est important de faire au moins des triplicats de ses points pour pouvoir lisser les résultats avec un test statistique permettant leur interprétation. Passé 40 cycles il est plus difficile de quantifier à cause des différents évènements stochastiques qui se produisent dans la réaction. Cependant, on peut encore avoir une réponse dans certains cas (ex: expression ON/OFF, votre gène n'est pas du tout exprimé dans une condition et l'est toujours dans une autre.)
Je pense que ne plus tenir compte de ces gènes est dommage parce que c'est certainement une perte d'informations. Il faut simplement adapter son analyse.

Cordialement,
piwi

[kamor]

Merci pour votre réponse.
En fait ma PCR est programmé sur 35 cycles, mes puits positifs ont un CT de 14-17 donc de ce côté il n'y a pas de problèmes.
Mon problème c'est vraiment l'interprétation d'un pic de fusion situé en dessous du seuil. Je crois comprendre qu'on peut relier la surface du pic à la quantité d'amplicons formés. Si c'est bien le cas, le fait que le pic ne dépasse pas le seuil est il un facteur éliminatoire?
Merci en tout cas pour vos réponses.

[kamor]

Désolé je viens de remarquer que mon png n'est pas passé, je rééssaye

[LXR]

Les courbes situées tout en bas du graphique ressemblent fortement à ce que l'on obtient dans les puits "blancs" (mix de qPCR sans ADNc). Dans ce cas là, cela est tout à fait normal et valide par la même occasion vos conditions de PCR.

Ce que tu dis Piwi m'intéresse fortement! Si tu penses qu'il est dommage de se délester de gènes sortant au-delà de 35 cycles, cela veut certainement dire que tu as obtenu des courbes de fusion validant des quantifications sur de tels gènes. Donc des courbes de fusion où l'on voit se dessiner un pic. Dans mon cas, pour ce type d'expression, il n'y a pas un seul gène qui ait une courbe de fusion correcte, cela ressemble à du bruit de fond. Cela m'embête énormément car ces gènes sont super bien modulés dans les conditions voulues par rapport au contrôle, ils sont assez nombreux, et les modulations sont reproductibles...Utilises-tu du syBRGreen ou une sonde Taqman? Appliques-tu un mode opératoire particulier quand tu es confronté à ce genre de situation (surtout pour la validation, pour s'assurer que ce n'est pas du non spécifique)?

Merci d'avance

Greg