Extraction ARN bactéries lactiques

[Lord M]

Salut !

Je cherche actuellement à extraire les ARN totaux de cellules de bactéries lactiques dans le but de faire de la RT-PCR quantitative (mesure de l'expression d'un gène dans différentes conditions).

J'aimerais savoir si certains ont déjà réalisé ce type de manips, et si oui quelle méthode d'extraction a été utilisée.

Mreci d'avance

[MaliciaR]

Hello,

Tu peux utiliser les kits de chez Qiagen (Maxi/Midi kit QIAGEN RNeasy (Références 75162 et 75142, respectivement). Afin de minimiser la contamination par l'ADN génomique, la préparation est digérée sur colonne par la DNase RNase-free (QIAGEN, référence 79254).

Sinon, il y a un protocol pas mal du tout : http://www.pasteur.fr/recherche/geno...N_Bacillus.pdf

Voilà, espérant que ça te serve!

Bien cordialement,

[Lord M]

Salut !

Merci pour les liens. J'ai déjà essayé le kit Qiagen sans succès Je comptais justement essayer un protocole similaire à celui de Pasteur aujourd'hui, ca va me permettre de comparer et complèter.

[MaliciaR]

Salut,

Sais-tu pourquoi ça n'a pas marché avec les kits Qiagen?

Sinon, à part eux, il y a le protocol au trizol qui est fréquemment utilisé... S'il ne marche pas non plus, 'e sais pas... Mais dis ce qu'il en est, ça m'intéresse

Cordialement,

[Lord M]

Salut !

Malheureusement je n'ai pas le temps de me pencher sur le pourquoi du non fonctionnement du kit Qiagen. Plusieurs solutions : cellules trop résistantes (mais après digestion au lyzozime et bead beatter ca devrait suffire), kit trop vieux (2 ans qu'il traine dans le labo), erreur de manip...

[wishangel]

Salut à toi,

effectivement un traitement chimique et méca est suffisant pour casser les cellules. Perso j'utilise aussi le kit Qiagen sur mes gram + avec lyse méca et RLT beta mercapto préalable. Sinon effectivement tu peux utiliser le Trizol si tu en as. Tu doit pouvoir trouver le manuel sur le site d'invitrogen.
bon courage

[MaliciaR]

Salut,

un truc qui vient de me passer par la tête : je sais avoir utilisé de la lysostaphine pour lyser le Staph aureus (comme il est Gram+...). Donc, si tes bactos lactiques sont trop résistantes
La lysostaphine est d'ailleurs utilisée pour des tests de présence de Staph dans les produits laitiers et viande, si ma mémoire est bonne.

Bon courage et donne des nouvelles, c'est intéressant!

Cordialement,

[Squalor]

Yop!

http://www.amsbio.com/showroom/rna_bee.aspx

tres facile à utiliser et marche très très bien !!
Seuls problèmes : Pas mal dangereux et assez cher (210 Pounds pour 200 mL)

On utilise ca pour extraire les ARN totaux de cerveaux de souris et de nos cultures cellulaires (=> et donc pourquoi pas bactéries..)


Amicalement,

Greg

[Lord M]

Salut !

Je remonte brièvement ce fil à la surface pour donner quelques nouvelles. J'ai enfin réussi à extraire une quantité suffisante d'ARN de mes bactéries (voire même trop, je suis obligé de diluer ^^) en utilisant la méthode au tri-reagent (équivalent du trizol) et au phénol-chloroforme de Milohanic et al. modifiée.

Le problème principal venait de la quantité initiale de cellules : au lieu de partir de 1 ou 2 ml de culture comme recommandé, je suis parti de 4 à 8 ml de culture en milieu de phase exponentielle de croissance.