Extraction d'ADN

[Ry-Alistik]

Bonjour la communauté,

Je tiens d’abord à dire qu’étant nouveau, non habitué de ce forum et débutant en la matière, pardonnez moi si je place mal ce sujet !

Je commence à m’intriguer par tout ce qui touche à l’ADN. J’ai donc fait des recherches sur notre ami google et j’ai trouver sur un site, des TP ( Travaux Pratiques ) à faire et qui de plus était assez instructif.

J’ai donc tenté une expérience chez moi mais seulement voila… vu mon grand manque d’expérience, j’ai besoin d’aide et de lumière sur certaines chose. Voici tout d’abord le TP en question :

a-Préparation du tissu végétal

• Couper un kiwi en deux et l’éplucher. Récupérer dans le mortier la chair du fruit en coupant celle ci en petits morceaux (éliminer la partie ferme centrale du kiwi).

• Broyer la chair de kiwi à l’aide du pilon, et transférer le tout dans un bécher. Prendre soin de récupérer le maximum de chair de kiwi lors du transfert.

b-Traitement des cellules végétales de kiwi

• Ajouter, à l’aide de l’éprouvette, 40 mL de solution de NaCl à 60 g/L, puis 15 gouttes de solution détergente. Mélanger doucement à l’aide de la spatule pendant environ 20 secondes.

• Filtrer le contenu du bécher sur du papier filtre, et récupérer le filtrat dans l’Erlenmeyer. Presser légèrement et très délicatement le filtre pour récupérer un maximum de filtrat.

c-Visualisation de l’ADN

• Homogénéiser doucement le contenu de l’Erlenmeyer, puis transférer 10 mL de ce filtrat dans l’éprouvette. Ajuster ensuite le volume jusqu’à 40 mL avec la solution froide d’éthanol à 90° (verser très délicatement et lentement la solution d’éthanol).

• Laisser reposer le contenu de l’éprouvette pendant quelques minutes. L’ADN apparaît sous forme d’une pelote blanche.

III-Compte rendu

1-Construire un schéma expérimental de la manipulation. Dessiner pour chaque étape du mode opératoire le matériel mis en jeu et les différents réactifs utilisés.

2-Décrire l’aspect final de l’ADN extrait. L’ADN est-il soluble dans la solution d’éthanol ?

3-L’objectif de cette manipulation était d’extraire l’ADN qui est renfermé dans le noyau des cellules de kiwi.
En prenant en compte vos connaissances sur la structure d’une cellule végétale et sur la nature chimique et les propriétés de ses constituants, expliquer l’intérêt des étapes a et b du mode opératoire ainsi que leur impact sur la structure cellulaire.

Le numéro 1 ne me pose pas de problème à vrai dire Mais ce sont plutôt les deux autres points !

J’aimerai avoir votre expérience sur la question numéro 2 et 3 afin de comprendre le pourquoi.

Voici ce que j’ai répondu ( ne sachant bien sur pas grand-chose dans ce domaine ) :

2) Oui l’ADN est soluble car à la fin de l’expérience, nous pouvons constater visiblement l’ADN.

3) Le fait d’écraser le kiwi en ayant éliminé la partie centrale, permet de libérer les cellules et de les écraser afin d’en libérer le contenue, ce qui donne avec le mélange des produits, la solution finale

Des points à corriger ? A mieux expliquer ? Merci à vous

[Mecton]

Bonjour,

l’ADN est soluble car à la fin de l’expérience, nous pouvons constater visiblement l’ADN

Et s'il était insoluble il serais invisible à l'oeil ?
Un sucre se solubilise dans l'eau, un morceau de fer, lui , est insoluble. Lequel reste visible après immerssion ?

Pour la question 3, je pense qu'ils veulent aussi que tu dises à quoi sert le NaCl , le détergent et l'alcool.

Bon courage,

[Ry-Alistik]

Hé bien le fer reste visible après immersion tandis que le sucre non puisqu'il donne un mélange homogène. Donc le mélange à la fin est insoluble alors car il ne se dissout pas dans le produit. ( Sinon, si c'est encore mauvais, c'est que je commence à m'embrouiller ^^ )


Pour la question 3, je ne saurai pas décrire exactement le rôle de chaque produit. Par contre je pense que l'éthanol permet de "cristaliser" une fois mélanger avec le contenue afin de faire apparaitre l'ADN.(?)

[Mecton]

Hé bien le fer reste visible après immersion

Il est insoluble : on le voit. Le sucre est soluble , on ne le voit plus. Maintenant il est facile de répondre à la question 2.

je pense que l'éthanol permet de "cristaliser"

Oui je dirais comme toi, mais à la plce de "cristaliser" il vaut mieux utiliser "précipiter".
Je pense que ce n'est pas le mélange NaCl/détergent qui permet cette précipitation d'ADN. L'ADN ,tout seul, précipite dans l'alcool.
NaCl et le détergent ont plutôt un rôle dans les phases d'extraction de l'ADN mais ça m'étonnerait que l'exercice te demande de donner leurs rôles.

Bah moi aussi j'vais demander de l'aide pour comprendre ton T.P :

On broit des cellules sans parois, celles du mesocarpe du Kiwi, car les cellules sont plus facilement éclatables.
Le broyage éclate les cellules, libère l'ADN.
Le NaCl sert à ..... ???
Le détergent capture les membranes plasmiques des cellules éclatées et les empêche de passer dans le filtrat.
La filtration ne laisse passer que les molécules, dont l'ADN.
L'alcool précipite l'ADN.

C'est juste ou pas ?

Cordialement,

[MaliciaR]

Bonjour,

Le NaCl, c'est le sel Que se passe-t-il si l'on met une cellule dans :
1. une solution hypertonique?
2. une solution isotonique?
3. une solution hypotonique?

Le détergent (savon, par exemple) sert à quoi, en effet? Comment fait-il pour "capturer" les membranes?

Cordialement,

[piwi]

Bonjour,
Le broyage ne sert pas à éclater les cellules. Une cellule c'est minuscule et ca résiste au pilon. Le broyage sert juste à eclater les tissus et séparer les cellules pour pouvoir ensuite les rendre accessissbles au détergeant qui lui va lyser les membranes et en liberer le contenu.
L'alcool sert effectivement à précipiter l'ADN mais ceci est potentialisé par les sels tels que le NaCl qui vont permettre de liberer l'ADN de protéines qui y sont fixées.

Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

La question que je posais pour le détergent était destinée à Mecton Le détergent eclate les mebranes justement, il ne les capture pas
Puis, j'avais pensé aussi à la paroi de la cellule végétale : il devrait y avoir plasmolyse (la paroi éclate et donc les molécules, dont l'ADN sont libérées en-dehors de la cellule)...

Par ailleurs, j'avais vu ce TP au Palais de la Découverte, à Paris

Cordialement,

[Mecton]

Merci Piwi !
C'est le genre de TP dont on crois qu'on maitrise les principes quand on fait des études, alors que pas du tout !!!
Faut dire que les manips de TP c'est bien trop souvent présentées comme des recettes de cuisine bêtes et méchantes.

Puis, j'avais pensé aussi à la paroi de la cellule végétale : il devrait y avoir plasmolyse (la paroi éclate et donc les molécules, dont l'ADN sont libérées en-dehors de la cellule)...

Euh on éclate pas une cellule en la plasmolysant, c'est plutôt en la mettant dans un milieu hypotonique qu'on va l'éclatée.Et si parois il y a on aura peu de chances de la faire éclater, non ?

Cordialement,

[Mecton]

Le détergent .... Comment fait-il pour "capturer" les membranes?

Bah là je dirais qu'il se lie fortement aux chaines d'acides gras des glycerolipides, mais quelles liaisons forme t'il? comment accède t'il à ces acides gras ( qui ne sont pas directement accessible )? Si tu peus me renseigner ça serit sympô,
Cordialement

[Ry-Alistik]

Que d'aide ! Je vous en remercie

Donc le fait d'écraser avec le pilon sert juste à éclater le tissu afin de séparer les cellules pour ensuite dissoudre ( donc lyser ) avec le détergeant. De ce fait ca libère le contenue.

Le NaCl permet de libérer l'ADN de protéines pour augmenter le potentiel lors du mélange avec l'éthanol.

Une fois mélangé avec l'éthanol, cela permet de précipiter ( et non cristaliser ) l'ADN.

Je comprends beaucoup mieux maintenant.

Par contre :

Le NaCl, c'est le sel Que se passe-t-il si l'on met une cellule dans :
1. une solution hypertonique?
2. une solution isotonique?
3. une solution hypotonique?

C'est déjà un peu plus poussé ( pour ma part ). Tu pourrais m'éclairer MaliciaR ?

[hanaebio]

Salut Ry-Alistik
- Quand on place une cellule vivante dans une solution contenant plus de sel (une solution hypertonique) que la cellule elle-même, la concentration de l'eau est plus grande à l'intérieur de celle-ci qu'à l'extérieur. Autrement dit, il y a moins de molécules d'eau par unité de surface à 1'extérieur de la cellule parce que l'espace est occupé pour une bonne part par le sel. Dans ces conditions, 1'eau se déplace de l'intérieur de la cellule vers l'extérieur de la cellule.

- Par contre, si la concentration des molécules d'eau à l'extérieur de la cellule est trop grande (solution hypotonique), l'eau se déplace par osmose vers l'intérieur de celle-ci. Il en résulte un accroissement de la pression sur la paroi interne de la membrane cellulaire Si cette pression augmente trop, la membrane cellulaire éclatera.

- lorsque les deux solutions contiennent une concentration égale de particules, elles sont isotoniques, en équilibre osmotique 'il n'y aura ni gain, ni perte d'eau d'un côté ou de l'autre de la membrane.