extraction ARN

[wishangel]

Bonjour à tous,

j'espère que vous allez pouvoir me donner qq idées et j'aurai peut etre mm la chance de trouver qq ayant déjà eu affaire à mon problème.
En fait j'aimerai faire une extraction d'ARN d'une de mes souches bacteriennes.
Le problème c'est que ma proteine d'interet est produite uniquement lorsque ma bactérie pousse sur gélose. Je suppose donc avoir des transcrit uniquement dans cette situation. Je me suis penché un peu sur la question et je me demandais si c'est pas trop casse-gueule de récupérer mes cellules sur la gélose.
Si vous avez des info c'est avec plaisir.
bon aprem^^
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[piwi]

Bas si tu fais pousser un tapis bactérien tu devrais avoir des tonnes de bactéries que tu pourras récupérer. Je ne vois pas vraiment où se situe le problème.
Pour une extraction d'ARN exploitables tu n'as pas besoin d'avoir des kilos de cellules.

Cordialement,
piwi

[gorben]

Salut,

Tout depend de ce que tu comptes faire avec tes ARNs ! Si c'est juste pour dire "ils sont la" : pas de probleme; si c'est pour de la quantification, bon courage... a mon avis bosser sur des colonies dont tu n'as aucun moyen de verifier la phase de croissance c'est impossible pour calibrer...

Par contre, je suis egalement en train de me prendre la tete pour purifier une proteine qui ne s'exprime qu'en solide et pas du tout en liquide. C'est trop te demander sur quoi tu bosses, et si tu as une idee de pourquoi elle ne s'exprime pas en liquide? On peut en discuter ici ou en MP.

A+

[Squalor]

salut! Même s'il y en a peu, une petite Rt-PCR devrait règler pas mal l'affaire!

amicalement,

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[wishangel]

c'est vrai qu'en terme de quantité ca devrai pas poser pb. Mais pour récup les cellules je fait comment? Un peu de tampon et je gratouille? C'est vrai que j'ai pas de reel pb mais je venais surtout a la recherche de "petit truc" technique. Sinon effectivement ce que je voudrai c'est voir si les ARN "sont la" pour confirmer les structures opéroniques de mon cluster.

[jmbowie]

c'est vrai qu'en terme de quantité ca devrai pas poser pb. Mais pour récup les cellules je fait comment? Un peu de tampon et je gratouille? C'est vrai que j'ai pas de reel pb mais je venais surtout a la recherche de "petit truc" technique. Sinon effectivement ce que je voudrai c'est voir si les ARN "sont la" pour confirmer les structures opéroniques de mon cluster.

Toi, tu dois travailler sur les actinomycètes ou des bactéries pires encore: tu peux essayer de resuspendre tesz colonies/tapis dans de l'eau ou du Tris-EDTA (pour l'eau, absolument traitée au DEPC) et précipiter tout de suite les acides nucléiques.

Tu pourrais aussi essayer de cloner ton cluster dans une E.coli et de travailler chez cette hôte. Cela ne reflètera peut-être pas ce qui se passe chez ton hôte source...tout dépend de ce qui est connu de la machinerie transcriptionelle de ta bactoche

[jmbowie]

Bonjour à tous,

j'espère que vous allez pouvoir me donner qq idées et j'aurai peut etre mm la chance de trouver qq ayant déjà eu affaire à mon problème.
En fait j'aimerai faire une extraction d'ARN d'une de mes souches bacteriennes.
Le problème c'est que ma proteine d'interet est produite uniquement lorsque ma bactérie pousse sur gélose. Je suppose donc avoir des transcrit uniquement dans cette situation. Je me suis penché un peu sur la question et je me demandais si c'est pas trop casse-gueule de récupérer mes cellules sur la gélose.
Si vous avez des info c'est avec plaisir.
bon aprem^^

Pourquoi ne pas resuspendre dans du milieu de culture et culotter de suite puis passer à l'extraction ARN?

[jmbowie]

Salut,

Tout depend de ce que tu comptes faire avec tes ARNs ! Si c'est juste pour dire "ils sont la" : pas de probleme; si c'est pour de la quantification, bon courage... a mon avis bosser sur des colonies dont tu n'as aucun moyen de verifier la phase de croissance c'est impossible pour calibrer...

Par contre, je suis egalement en train de me prendre la tete pour purifier une proteine qui ne s'exprime qu'en solide et pas du tout en liquide. C'est trop te demander sur quoi tu bosses, et si tu as une idee de pourquoi elle ne s'exprime pas en liquide? On peut en discuter ici ou en MP.

A+

Pour la purification de la protéine, tu as essayer d'autre température de croissance? de même, on peut en causer en MP ou ici

[gorben]

Salut,

Pourquoi ne pas resuspendre dans du milieu de culture et culotter de suite puis passer à l'extraction ARN?

Pareil, je mettrai un peu de milieu de culture dans un tube et je resuspendrai quelques colonies dedans.
Attention a la quantitee, 1 colonie =10⁹ cellules et 1 ml de culture DO 0.5 = 5.10⁸ cellules...

A+