problème migration ARN gel agarose

[FELIXIA]

Bonjour à tous,
J'ai fait une extraction ARN méthode Qiagen RNeasy sur 50 mg de foie de rat, je n'ai pas encore dosé l'ARN, mais effectué un gel qui me donne cette image. Je ne trouve pas mes 2 bandes habituelles. Le gel est TBE 10% agarose+ 3µl BET et dépot avec 5µl de mon extraction+1µl bleu de charge.Quelqu'un a-t-il une idée sur un tel résultat? manip foirée, ARN en trop grande quantité, pas d'ARN,,????? autant de questions que je me pose, merci et à bientôt

[jmbowie]

Bonjour à tous,
J'ai fait une extraction ARN méthode Qiagen RNeasy sur 50 mg de foie de rat, je n'ai pas encore dosé l'ARN, mais effectué un gel qui me donne cette image. Je ne trouve pas mes 2 bandes habituelles. Le gel est TBE 10% agarose+ 3µl BET et dépot avec 5µl de mon extraction+1µl bleu de charge.Quelqu'un a-t-il une idée sur un tel résultat? manip foirée, ARN en trop grande quantité, pas d'ARN,,????? autant de questions que je me pose, merci et à bientôt

L'image ne peut pas être visualisé pour le moment, mais un gel à 10% cela me semble énorme! Je suppose que tu ne dois voir qu'une grosse patate tout en haut du gel avec peut-être un peu de smir de dégradation...les ARN migrent bien sur des gels à 0,5-1% .

Il est possible aussi que tu es exposé trop fort aux UV, de ce que tu décris ("ARN en trop grande quantité") ce qui te donne des patates

[FELIXIA]

C'EST EFFECTIVEMENT UNE ERREUR de frappe LE GEL EST BIEN a 1% et j'ai une migration aux UV sans détachement, pas de bandes distinctes, 2 puits emettant la ligne totale de migration aux UV .Quand la photo sera disponible ce sera + parlant

[FELIXIA]

la photo est dispo car quand je clique dessus, elle s'affiche

[jmbowie]

C'EST EFFECTIVEMENT UNE ERREUR de frappe LE GEL EST BIEN a 1% et j'ai une migration aux UV sans détachement, pas de bandes distinctes, 2 puits emettant la ligne totale de migration aux UV .Quand la photo sera disponible ce sera + parlant

Il s'agit très probablement d'ARN dégradé alors...

[Bacillus 100]

J'ai deja eu une photo qui ressemble à celle la!!! quand t'as repris ton ARN avec le tampon de charge t'as sentie une viscosité?
Je pense que c'est l'extraction qui ne s'est pas trés bien déroulé. tu utilise le trizol?

[jmbowie]

Pourrais-tu nous donner ton protocole d'extraction d'ARN ? Merci

[Yoyo]

Depose 10 et 100 fois moins d'ARN sur ton gel.
Je pense que tu as simplement trop de materiel.

YOyo

[jmbowie]

Depose 10 et 100 fois moins d'ARN sur ton gel.
Je pense que tu as simplement trop de materiel.

YOyo

Je propose aussi de déposer à côté une quantité connue de marqueur de poids moléculaire au cas ou ce serait l'exposition qui serait trop forte.

[piwi]

Je pense surtout qu'avant de faire migrer de l'ARN il faut être certain qu'il est bien redissout dans le TE ou l'eau et l'avoir dosé. Parce que là c'est compliqué de dire où se trouve le problème. Peut être que vous avez mis tous vos ARN dans le gel sans le savoir, où qu'ils sont super concentrés. Avant de faire quoi que ce soit de plus, un petit coup de spéctro vous donnera une indication.

[Borh]

question idiote, mais as-tu bien fait migré ton dépot dans des conditions RNase free (c.a.d, cuve, gel, tampon, bleu cônes de dépot etc ...) ?

[Yoyo]

question idiote, mais as-tu bien fait migré ton dépot dans des conditions RNase free (c.a.d, cuve, gel, tampon, bleu cônes de dépot etc ...) ?

De toute maniere meme une contamination par une RNAse ne permettrait pas de voir ce type de migration

Yoyo

[Borh]

A partir du moment où l'ARN est dégradé dans le puit, on peut avoir un smire (orthographe ?). Et il me semble que c'est bien un smire que l'on voit sur le gel. Alors effectivement, l'intensité laisse à penser que la quantité déposée est trop importante également. Mais si on part du principe que l'ARN n'est pas dégradé, alors le mire visible correspond aux ARNm et il faudrait une concentration monstrueuse en ARN total pour que les ARNm donné ce genre d'image.

[Yoyo]

A partir du moment où l'ARN est dégradé dans le puit, on peut avoir un smire (orthographe ?). Et il me semble que c'est bien un smire que l'on voit sur le gel. Alors effectivement, l'intensité laisse à penser que la quantité déposée est trop importante également. Mais si on part du principe que l'ARN n'est pas dégradé, alors le mire visible correspond aux ARNm et il faudrait une concentration monstrueuse en ARN total pour que les ARNm donné ce genre d'image.

Les RNAses sont tellement efficaces que si il y en avait une qui trainait on verrai une tache tres lumineuse dans le bas de gel.
Deplus le fait que le smear commence des le puit laisse presager que le materiel déposé n'est pas propre, et il est de toute facon beaucoup trop concentré.

YOyo

[FELIXIA]

le protocole est RNeasy de qiagen et je l'avais testé en stage et tout était correct, de plus, j'ai ajouté la RNase Free non obligatoire à mon protocole. La semaine prochaine je les dose et j'essaie d'en faire migrer 10 fois moins avec un marqueur. Merci à tous pour vos bon conseils et je vous informerais de mon résultat. j'espère uniquement que c'est parce que j'ai beaucoup de matériel, on peut toujours rêver!!!!! sinon, il faut que je me remette en question sur mon protocole et toute lamanip et savoir où j'ai pu contaminer si c'est le cas et là, c'est pas simple car je pense avoir tout fait dans les conditions habituelles de protection de contamination.
A+