PCR & Southern Blot

[babaz]

Bonsoir,

D'après ce que j'ai compris, tout comme le southern blot, la PCR permet de déterminer la longueur (nombre de bases) d'une molécule d'ADN, préalablement traitée par des enzymes de restriction.

On nous a dit que la PCR était aujourd'hui avantagée, puisque bien plus rapide que le southern blot.

J'aurais deux questions concernant la PCR :

- Si le southern blot nécessite, le plus souvent, l'utilisation de sondes marquées radioactivement (pour pouvoir localiser, sur une électrophorèse, les différentes séquences), qu'en est-il de la PCR ? Les amorces utilisées sont-elles nécessairement marquées au préalable ?

- Il me semble que les polymérases de type I détruisent à un moment donné de la réplication les amorces. Pourquoi ces amorces ne disparaissent-elles pas progressivement durant les différents cycles d'une PCR ?

Je vous remercie
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[wishangel]

Salut à toi,

a priori le principe de la PCR n'est pas très bien compris. C'est une technique qui permet d'amplifier un fragment d'ADN spécifique. Sa principale utilisation n'est pas de déterminer la taille de ce fragment. Tu devrais jeter un coup d'oeil sur le net car c'est une technique courement utiliser et tu trouvera des eplication assez facilement.
PCR et Southern ne sont pas utiliser dans le même but mais ils peuvent être fait de façon complémentaire. Pour ce qui est de la révélation lors du southern effectivement la sonde doit être marqué (pas obligatoirement par radioactivité d'ailleurs). Pour la PCR les fragment amplifié sont visualiser après migration sur gel d'agarose contenant du BET (bromure d'ethidium), c'est une molecule qui s'intercale entre les base de l'ADN qui devient fluorescent sous UV.

JE suis pas sur d'avoir été très clair et je pense que tu gagnera du tps en te documentant un plus sur la PCR. Car je sus pas très doué pour les longe explication ^^

[invite30157012]

Je suis d'accord, la PCR en elle-même ne permet pas de déterminer la taille d'un fragment mais de l'amplifier.
Bien sûr après l'amplification tu peux le faire migrer sur un gel et ainsi évaluer sa taille, mais la PCR a elle seule n'a pas ce but.

[babaz]

Merci beaucoup. J'ai eu l'occasion de me documenter entre temps. Cette méthode (PCR) peut donc servir à évaluer la taille d'une séquence mais sert surtout à confirmer la présence d'une séquence ?!?

Une question reste :

On nous a dit que la PCR était bien plus rapide que le southern blot. Savez-vous pourquoi ?

Merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[wishangel]

La PCR prend entre 1/2 et 1 journée (amplif + verif sur gel) alors que pour le southern il faut compter entre 2 et 3 jours (digestion génomik, migration, transfert, hybridation, révelation)

[babaz]

Merci beaucoup.

Les amorces nécessaires pour le bon déroulement d'une PCR s'hybrident. Est-ce aussi long que l'hybridation de sondes, dans le cas du southern blot ?

[invite64e85d2a]

tu utilises aussi des sondes lors de ta PCR pour révéler tes différentes migrations sur gel
tu peux aussi faire passer le résultat de ta PCR par capillaire éléctrophorétique, qui te permet ainsi de comparer la taille de tes fragments de PCR à des fragments test couplé à des oligosondes qui émèttent dans des longeurs d'ondes différentes.

Donc dans les 2 cas tu utilises des hybridation de sonde comme pour southern blot (ou northern ou Western)

[invite30157012]

Non pas forcément, comme le disait wishangel, tu peux faire migrer ton ADN sur gel d'agarose avec du BEt et visualiser tes fragments sous UV.

[wishangel]

Oui et pour la PCR personnellement ma durée d'hybridation est de 30sec. Il faut savoir que la taille d'une amorce n'a rien avoir avec la taille d'une sonde...

[invite64e85d2a]

Non pas forcément, comme le disait wishangel, tu peux faire migrer ton ADN sur gel d'agarose avec du BEt et visualiser tes fragments sous UV.

Mais je suis pas sur que dans ce cas là tu puisses en déduire la taille de ton fragment

[jmbowie]

Mais je suis pas sur que dans ce cas là tu puisses en déduire la taille de ton fragment

Si, si tu le fais migrer en même temps qu'un marqueur de poids moléculaire = mélange de fragments d'ADN de taille connue (cela peut être un ADN de ta collection digéré par des enzymes à ta convenance)

[invite64e85d2a]

c'est pas faux ! mais c'est surement moins précis, mm si c'est plus rapide à mon avis que l'utilisation d'un capillaire électophorétique ( et surement plus abordable financièrement =)