Fréquence de sites de restriction

[MaliciaR]

Bonjour,

J'ai une question concernant les sites de restriction.
Si l'on décide de calculer la fréquence d'un tel site, par exemple pour une enzyme site-spécifique genre (allez, simple) Sau3A : NGATCN et que l'on admette que les pb sont distribuées de façon aléatoire, on aura une proba de 1/4 de trouver n'importe laquelle des paires (A-T, T-A, G-C, C-G) pour chaque position.
Donc, pour le site NGATCN, on aura :
P(N)=1; P(G)=1/4; P(A)=1/4; P(T)=1/4; P(C)=1/4; P(N)=1.

La probabilité de rencontrer un site Sau3A est donc de : 1*1/4*1/4*1/4*1/4*1= 1/256. On pourra dire que dans ces conditions, en moyenne, l’enzyme Sau3A coupe l’ADN tous les 256 nucléotides.

La taille du génome de P. aeruginosa est = 6,3^10⁶ pb. Donc, avec le calcul ci-dessus, on aura que la taille moyenne des fragments est de 7000pb.

Jusqu'ici, ça va. Là où ça se gate est lorsque vient la question : sur 100 sites Sau3A, combien sont potentiellement digérés par l’enzyme?
Je suppose qu'il y a quelque chose à considérer du genre "perte d'activité enzymatique"...? Mais je patauge un peu

Merci.
Cordialement,
-----

[piwi]

Salut,
Tu donnes toutes les données là où tu vas à ce qui te semble être l'essentiel?

piwi

[jmbowie]

Bonjour,

J'ai une question concernant les sites de restriction.
Si l'on décide de calculer la fréquence d'un tel site, par exemple pour une enzyme site-spécifique genre (allez, simple) Sau3A : NGATCN et que l'on admette que les pb sont distribuées de façon aléatoire, on aura une proba de 1/4 de trouver n'importe laquelle des paires (A-T, T-A, G-C, C-G) pour chaque position.
Donc, pour le site NGATCN, on aura :
P(N)=1; P(G)=1/4; P(A)=1/4; P(T)=1/4; P(C)=1/4; P(N)=1.

La probabilité de rencontrer un site Sau3A est donc de : 1*1/4*1/4*1/4*1/4*1= 1/256. On pourra dire que dans ces conditions, en moyenne, l’enzyme Sau3A coupe l’ADN tous les 256 nucléotides.

La taille du génome de P. aeruginosa est = 6,3^10⁶ pb. Donc, avec le calcul ci-dessus, on aura que la taille moyenne des fragments est de 7000pb.

Jusqu'ici, ça va. Là où ça se gate est lorsque vient la question : sur 100 sites Sau3A, combien sont potentiellement digérés par l’enzyme?
Je suppose qu'il y a quelque chose à considérer du genre "perte d'activité enzymatique"...? Mais je patauge un peu

Merci.
Cordialement,

Tout dépend des conditions de ta digestion , notamment de la quantité d'ADN génomique que tu fais digérer pour une certaine quantité d'enzyme.
En général, 1 U d'enzyme est définie comme étant la quantité suffisante pour digérer 1microgramme d'ADN d'un génome connu (le plus souvent, l'ADN du phage lambda).
Avec certaines enzymes, si tu charges trop en unités d'enzymes, tu peux même avoir 102, 103 ou 400 restrictions pour 100 sites spécifiques
(activité "star")

[MaliciaR]

Salut,
Tu donnes toutes les données là où tu vas à ce qui te semble être l'essentiel?

piwi

Le souci est que je donne toutes les données...

Je crois que le prof a baragouiné un truc du genre 7000/256 pour la fréquence, mais pourquoi...?

Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[jmbowie]

Le souci est que je donne toutes les données...

Je crois que le prof a baragouiné un truc du genre 7000/256 pour la fréquence, mais pourquoi...?

Cordialement,

La fréquence, tu l'as bien déterminé pourtant :/

Moi j'aurai bien répondu "tous"mais si c'est une question d'ouverture, on peut trouver des raisons pour qu'une enzyme ne coupe pas (mais sans déterminer combien)

[invite160a5434]

Ca serait bizarre de rediviser le nombre théorique de site de restriction parla probabilité d'avoir un site de restriction. Je pense que, comme l'a dit jmbowie, il faudrait voir s(il ne faut pas considéré une digeston ménagée ou tout les sites ne sont pas clivé.

Il y a plein de raisons pour ne pas couper à un site de restriction, méthylation, mutation, conformation ...

[MaliciaR]

La fréquence, tu l'as bien déterminé pourtant :/

Oui, exact, je me suis plantée
En fait, 7000/256 serait le facteur de perte d'activité enzymatique. Pour savoir combien de site ne subiraient pas de digestion, il suffirait de diviser le nombre de sites total par ce facteur.
C'est ce que j'ai dans mon petit cahier
Mais pourquoi?

Moi j'aurai bien répondu "tous"mais si c'est une question d'ouverture, on peut trouver des raisons pour qu'une enzyme ne coupe pas (mais sans déterminer combien)

Oui, on est d'accord là-dessus. Et c'est une question facultative, du genre "petite question pour le cas où vous n'auriez rien à faire de votre soirée avant contrôle"

Cordialement,

[MaliciaR]

Il y a plein de raisons pour ne pas couper à un site de restriction, méthylation, mutation, conformation ...

Oui, très certainement, mais il n'est pas question de ça ici... (Malheureusement...).

C'est Tres Simple :s:

Cordialement,

[jmbowie]

Oui, exact, je me suis plantée
En fait, 7000/256 serait le facteur de perte d'activité enzymatique. Pour savoir combien de site ne subiraient pas de digestion, il suffirait de diviser le nombre de sites total par ce facteur.
C'est ce que j'ai dans mon petit cahier
Mais pourquoi?



Oui, on est d'accord là-dessus. Et c'est une question facultative, du genre "petite question pour le cas où vous n'auriez rien à faire de votre soirée avant contrôle"

Cordialement,

A quoi cela sert de calculer le nombre de quadruplets non reconnus si on connait ceux reconnus à part faire faire des stats? J'aurais trouvé plus pertinent de faire réflechir les étudiants sur le fait que le nombre réel de sites dans le génome d'une bestiole n'est pas celui théorique et demander des hypothèse pour l'expliquer.
Il veut surement parler de "quadruplets" plutot que de sites alors

[MaliciaR]

Il veut surement parler de "quadruplets" plutot que de sites alors

Je ne crois pas... J'ai la même question pour BamHI où le site est un sextuplet...
Je ne comprends même pas pourquoi nous poser la question, d'ailleurs... si ce n'est pour de la gymnastique après-digestive...
Cordialement,

[invite32ebe868]

Il faut prendre en compte dans le calcul, le pourcentage de GC dans le génome car si il n'est pas de 50%, tous est faux.

[MaliciaR]

Il faut prendre en compte dans le calcul, le pourcentage de GC dans le génome car si il n'est pas de 50%, tous est faux.

En fait, vu les probabilités de rencontre des pb, on comprend implicitement que le pourcentage de GC est considéré comme égal à celui d'AT.
Sinon, ta remarque est tout aussi valable dans le sens "prendre en compte le pourcentage de AT"

Cordialement,

[Yoyo]

En fait, vu les probabilités de rencontre des pb, on comprend implicitement que le pourcentage de GC est considéré comme égal à celui d'AT.

Je comprends pas ta remarque? il est clair que le %GC du génome varie tres fortement d'un organisme a un autre. Si on veut faire une probabilité fiable, il est indispensable de la prendre en compte.

YOyo

[MaliciaR]

Bonjour,

On nous dit de considérer qu'avec ces probabilités on a un pourcentage de GC egal à celui de AT. Si ce n'était pas le cas, je n'aurais pas eu une probabilité égale de touver A-T (T-A) que G-C (C-G), il me semble... Ou, si j'avais eu des précisions sur les %, j'aurais pondéré les probas par ces pourcentages...
C'est justement pour cette raison que le calcul ne prend pas en compte des cas où le % GC serait de tant ou de tant.
Perso, je trouve tout ça inutile et aux limites du correct, mais ce qui m'énerve c'est de ne pas comprendre la démarche de la deuxième partie.
Le calcul du nombre de sites qui ne seront pas clivés est bien celui-ci :
* on divise 7000/256,
* cela nous donne un facteur de perte d'actvité enzymatique de l'enzyme;
* on divise le nombre total de sites de restriction (ici, on nous dit que c'est 100 pour Sau3A) par ce facteur et on aura le nombre de sites qui ne seront potentiellement pas digérés.

C'est tout cela qui me gêne parce que pour moi il y a trop d'approximations qui faussent les choses et puis, je ne comprends pas ce calcul trop simpliste...

Merci pour vos réponses

Cordialement,

[Yoyo]

ah oui désolé j'avais pas suivi tout ...

j'ai un probleme avec tes fragments ayant en moyenne 7000pb
je comprends pas comment avec une enzyme qui coupe en moyenne tous les 256nt, tu peux obtenir des fragments de 7000pb!?...

Sau3A etant bloquée par les methylations des CpG, cela signifie que le site ne sera pas coupé si il y a un C devant ou un G derriere. Donc tu peux calculer une nouvelle probabilité de coupure réelle non?

Yoyo

[MaliciaR]

j'ai un probleme avec tes fragments ayant en moyenne 7000pb
je comprends pas comment avec une enzyme qui coupe en moyenne tous les 256nt, tu peux obtenir des fragments de 7000pb!?...

C'est ce que j'avais remarqué et le prof a dit : "c'est dans le cas d'une digestion ménagée". Je viens de relire mes notes et j'ai vu un gros ? à côté de cette affirmation.

Du coup, ça m'embrouille encore davantage

Sau3A etant bloquée par les methylations des CpG, cela signifie que le site ne sera pas coupé si il y a un C devant ou un G derriere. Donc tu peux calculer une nouvelle probabilité de coupure réelle non?

Dit ainsi, je vois ce que tu veux dire.
Mais ensuite, j'ai la question : "faire pareil avec BamHI". Je suppose que l'idée n'est pas de nous faire faire un catalogue des régulations des enzymes de restrictions, mais de nous faire appliquer ce calcul.

Yoyo, tu en penses quoi, de ce truc?

Cordialement,

[piwi]

Le calcul du nombre de sites qui ne seront pas clivés est bien celui-ci :
* on divise 7000/256,
* cela nous donne un facteur de perte d'actvité enzymatique de l'enzyme;
* on divise le nombre total de sites de restriction (ici, on nous dit que c'est 100 pour Sau3A) par ce facteur et on aura le nombre de sites qui ne seront potentiellement pas digérés.

Je ne comprends pas ce calcul. Je ne vois pas en quoi diviser le nombre de fragments générés (si ou coupe à 100% d'efficacité) avec la probabilité de couper donne quelque chose ressemblant à un rendement.
De plus ce facteur de perte d'activité serait une fonction de l'organisme considéré et non pas de l'enzyme.

Ca n'a pas de sens pour moi...

[MaliciaR]

Je ne comprends pas ce calcul. Je ne vois pas en quoi diviser le nombre de fragments générés (si ou coupe à 100% d'efficacité) avec la probabilité de couper donne quelque chose ressemblant à un rendement.
De plus ce facteur de perte d'activité serait une fonction de l'organisme considéré et non pas de l'enzyme.

Ca n'a pas de sens pour moi...

On est deux, Piwi...

C'est pour cette raison que je pose la question. Encore, on m'aurait demandé de faire un calcul en bonne et due forme d'activité enzymatique comme en bioch, je veux bien comprendre pourquoi je le fais. Mais ça?

Cordialement,

[Yoyo]

Ah ok,

donc si Sau31 coupe a 100% on obtient en moyenne des fragments de 256nt.
Or la tu obtiens des fragmenst de 7000nt. ce qui signifie que 1 site sur 27 ( a peu pret est coupé). Donc maintenant sur 100 sites tu sais qu'il y en a a peu pres 3 de coupé

YOyo

[MaliciaR]

Ah, ok...
Donc, tout ce charabia totalement insensé était supposé nous mener ici

Merci, Yoyo

Cordialement,

[Yoyo]

de rien

YOyo

[piwi]

Arg, je m'a fais eu en comprenant que l'on générait 7000 fragments (ce qui, à vue d'oeil, n'est pas choquant si on coupe toutes les 250 pb) et non pas que les fragments faisaient 7000pb.... Shame on me!!

Comme quoi il faut toujours bien lire et ne jamais se relâcher. Une bonne leçon pour moi! (on a toujours besoin de petites leçons pour rester vigilant)

Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

Arg, je m'a fais eu en comprenant que l'on générait 7000 fragments (ce qui, à vue d'oeil, n'est pas choquant si on coupe toutes les 250 pb) et non pas que les fragments faisaient 7000pb.... Shame on me!!

Comme quoi il faut toujours bien lire et ne jamais se relâcher. Une bonne leçon pour moi! (on a toujours besoin de petites leçons pour rester vigilant)

Cordialement,
piwi

C'est la première fois que je te vois faire une erreur et c'est rassurant

Sinon, pour continuer sur le thème, j'ai une question de pinailleuse
La fin de cet exo est : combien de clones indépendants N sont nécessaires pour obtenir avec une probabilité P= 0.99 un clone particulier?

Le nombre de clones indépendants N: dépend de la taille du génome G représenté dans la banque et de la taille moyenne des fragments clonés L (inserts).
N peut être déterminé avec la formule suivante :

N = [log (1- 0,99)] / [log (1- L/G)]

L= 7 kpb, G= 6,3*10^3 kpb => N = 4110 clones

(Faut que j'utilise le Latex la prochaine fois).

Ma question est : pourquoi log?

Cordialement,