Probleme de clonage avec pT7Blue

[inviteaf9cf7f8]

Bonjour,

Je viens de finir un TP de biologie moleculaire basic de L2 (en anglais) dont le but est d'experimenter les techniques de clonage, de selection bleue/blanc, d'analyse sur gel d'agarose par electrophorese ...ect

Voici les principales étapes du TP:

• Cloning the PCR product
• Preparation of the insert (End conversion reaction)
• Ligation reaction
• Transformation into NovaBlue singles Competent cells
• Sub culturing the colonies
• Plasmid DNS purification
• Digestion
• Analysis of plasmids, digestions and PCR products by gel electrophoresis

On obtient un gel avec des produits de PCR de colonies bleues et blanches, de plasmides digérés par enzymes de restriction et des plasmides non digérés provenant de colonies bleues et blanches. (= 6 bandes)+marqueur de taille

On a tenté un clonage du gene NDST-1 codant pour N-sulphotransferase/N-deacytlase-1 avec le plasmide pT7Blue en provenance d'un kit, mais le test positif ne fonctionna pas. Pourtant le control positif du kit ,un fragment obtenue par PCR , fut cloné exactement de la meme maniere que les produits de la PCR. Produits qui eux, ont fonctionnés...

Si j'ai bien compris, on a effectué le controle positif durant la reaction de "end conversion" qui est = 2uL des produits de la PCR +X uL de Nuclease-free Water+0.5 uL de End conversion mix.Le controle positif se fait en remplacant les produits de la PCR par le "blunt vector control insert". **Le "blunt vector control insert" est un produit de la PCR de 212pb amplifié par taq polymerase.

Mes questions sont =
Comment obtient-on les produits de la PCR de colonies bleues et blanches puisqu'on a fait cette experience au tout début du TP?

Qu'est ce qu'un controle positif ? Que controle t'on ?
Pourquoi n'a t'il pas fonctionné alors que le clonage des produits de la PCR si,et que tout fut réalisé de la meme maniere ?
Si le test ne fonctionne pas, il faut donc changer de vecteur ?

De plus le prof nous demande de décrire une autre méthode de clonage par PCR utilisant TOPO ou topoisomerase system. J'ai beau chercher, je ne trouve pas 'explication pour cette technique, il s'agit d'utiliser un vecteur TOPO? C'est une technique utilissée pour une petite quantité D'ADN simple brin ? Quelle est la difference avec la technique de PCR utilisée précédement ?

merci beaucoup pour vos réponses.
J'espere avoir donné assez de détails...
-----

[Yoyo]

salut

je pense que malheureusement tu as sauté bcp d'etapes, du coup c'est difficile de recoller les morceaux!
essaye de donner des infos supplementaires notamment sur le tout debut du TP

YOyo

[invite7ca7e8ff]

salut j'ai éssayé de définir les étapes de ton protocole

Voici les principales étapes du TP:

• Preparation of the insert (End conversion reaction)préparation de ton fragment,
  au passage il me semble qu'il manque une étape de PCR à ce niveau justement
  une étape de digestion (ouverture) de ton vecteur plasmidique (là où tu as inséré ton produit de PCR) par diverses enzymes de restriction
  
  [*]Ligation reaction: réaction de ligation, C'est à dire que tu as dû utiliser une enzyme qui a "collé" les extrémités de ton vecteur à celui de ton produit de PCR
  soit le fragment est inséré, alors tu as un vecteur recombinant
  soit il ne s'est pas inséré tu as un vecteur non recombinant
  c'est très important à comprendre !!!
  
• Transformation into NovaBlue singles Competent cells
  alors cette étape consiste à rendre compétentes les cellules dans lesquelles les plasmides obtenus seront transférés.
  cette étape est appelée la transformation
  là c'est pareil le plasmide(vecteur) peut rentrer dans les cellules, ou pas (tout dépend de la quantité, ....)
  ensuite il ne faut pas oublier qu'il y a 2 types de plasmides!!!!
  
• Sub culturing the colonies
  mise en culture des cellules, c'est ici que tu obtiens des colonies bleues et blanches, selon que le vecteur a été bien intégré et donc le produit de PCR
  ce qui est important à comprendre aussi c'est la coloration, elle est due à un gène lacZ, dans ton plasmide (regarde bien la structure de ton plasmide, donc du vecteur!!!). ce gène code pour une enzyme qui va couper un prosuit appelé X GAL avec lequel vous avez dû mettre les cellules en culture, sinon c'est pas possible que tu aies obtenu la coloration!!!!
  donc si l'insert(pcr product) est dans ton vecteur , il bloque le lac Z donc pas de coloration. je te passe les détails du pourquoi, du comment, tu cherches sur google, tout est expliqué !(ou dans tes cours)
  donc colonie blanches = vecteur recombinant
  mais peut être aussi cellules qui n'ont pas intégré le vecteur recombinant !!!(parce que sinon c'est trop facile)
  
  du coup on trie et on récupère les clones blancs
  le reste sert donc à vérifier que tu as bien inséré ton produit de PCR dans le vecteur!!!!
  
• Plasmid DNS purification : extraction de tes plasmides
• Digestion
• Analysis of plasmids, digestions and PCR products by gel electrophoresis

Mes questions sont =
Comment obtient-on les produits de la PCR de colonies bleues et blanches puisqu'on a fait cette experience au tout début du TP?: on a certainement dû vous épargné une grande partie du boulot, et regarde le protocole, elle vous a donné des produits déja tous faits, mais il faut que tu saches qu'avant d'obtenir des clones bleus et blancs, il y a eu toutes ces étapes!!!

Qu'est ce qu'un controle positif ? Que controle t'on ?
le contrôle positif set à vérifier que tu as bien ton insert et vecteur, soit pour vérifier ton électrophorèse (je ne sais plus ou alors les deux)
il te sert pour l'analyse de tes résultats, tu pourras le comparer aux plasmides extraits des clones blancs et bleus.

Pourquoi n'a t'il pas fonctionné alors que le clonage des produits de la PCR si,et que tout fut réalisé de la meme maniere ?
Si le test ne fonctionne pas, il faut donc changer de vecteur ?
il n'a pas fonctionné, certainement à cause d'une erreur de manipulation(pipettages) ou alors peut être qu'il était périmé, ce qui m'étonnerait!!

voilà j'espère t'avoir aidé un peu. bye et bon courage

[inviteaf9cf7f8]

salut , merci pour ces reponses, je vais essayer de donner plus de details sans non plus ecrire tout le polycopier...

Voici les principales étapes du TP: Je reprend plus en details

• Cloning the PCR product[/B]: = amplifié le gene d'interet pour pouvoir travailler dessu
  
• Analyse du fragment par gel electrophorese sur agarose = identifier la taille du gene amplifier
  
• Preparation of the insert (End conversion reaction) [/B]= redpréparation du fragment fait par le prof auparavant...Il a utiliser un "commercial PCR clean up kit"
  Nous avons ouvert le plasmide= end conversion reaction puis incubation 22'C 15 min, inactivation de cette reaction a 75'C pendant 5 min. Refroidissement dans la galce 2 min puis centrifugation. A moins que le plasmide soit deja ouvert, c'etait un kit commercial....
  
• Ligation reaction[/B]: ajout de 1uL de Blunt vector+1uL T4 DNA ligase a la "end-conversion" reaction.Incubation a 22'C pendant 15 min.
  
• Transformation into NovaBlue singles Competent cells[/B]
  alors cette étape consiste à rendre compétentes les cellules. Pas de soucis de comprehension.
  ensuite il ne faut pas oublier qu'il y a 2 types de plasmides!!!! ==== Comment ca deux types de plasmides ????
  
• Sub culturing the colonies[/B]
  mise en culture des cellules, c'est ici que tu obtiens des colonies bleues et blanches,
  donc colonie blanches = vecteur recombinant
  donc colonie bleues = vecteur non recombinant
  Et en effet,c'est ici qu'on a fait des PCR avec les bacteries bleues et blanches....
  
• Plasmid DNS purification[/B] : extraction de tes plasmides
  
• Digestion par enzyme de restrictions d'une partie des plasmides de colonies blanches et bleues.
  
• Analysis of plasmids, digestions and PCR products by gel electrophoresis
  obtention de 6 bandes + marqueur de taille afin de comparere les produits de la PCR brute, les plasmides digérés et les non digérés en provenance de colonies bleues et blanches.

Mes questions sont =

Pourquoi n'a t'il pas fonctionné alors que le clonage des produits de la PCR si,et que tout fut réalisé de la meme maniere ?
Si le test ne fonctionne pas, il faut donc changer de vecteur ?
il n'a pas fonctionné, certainement à cause d'une erreur de manipulation(pipettages) ou alors peut être qu'il était périmé, ce qui m'étonnerait!! = oui mais ce fut le cas pour pratiquement toute la classe, cela fait beaucoup d'erreur de manipulations.....lol. Je crois que juste un groupe a obtenu de tres legere colorations bleues.

Si j'ai bien compris le TP (en anglais...) vuque le test positif n'a pas marché avec pT7Blue plasmide, on a donc utiliser pBluescript, mais je n'en suis pas sure..... En cas de controle positif du kit commercial negatif, il faut donc changer le vecteur ? A quoi peut etre dut cet echec ?

merci d'avance

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteaf9cf7f8]

rectification,
le controle positif fut fait au debut du TP.... mais il ne marcha pas avec le plasmide pT7Blue, quelles sont les raisons possibles ?

Erreurs de manipulation exclus car cela affecte toute la classe....
Mauvais protocol exclus car le meme protocole avec PBluescript fonctionna....Mais bon ce deuxieme essai fut fait par le professeur.Je ne sait pas s'il n'a pas changer de solution qui aurait pu etre contaminee....


Et qu'est qu'un clanage par TOPO PCR ??
merci d'avance