Gros problème.....

[invite9a7a6874]

Bonjour,

je suis en stage de fin d'étude et j'ai un très gros problème.

je suis sensée créer un vecteur d'expression (Kit Qiagen pcDNA 3.1 TOPO isomerase) à partir de clones bactériens contenant notre protéine d'interet.
Nous avons designé des amorces à partir de ces clones et nous avons décidé d'utiliser une enzyme fidèle pour l'amplification (la Pfx).
J'ai donc lancé une préculture à partir de mes clones initiaux à 37° pendant la nuit, puis j'ai ensuite extrait l'ADN plasmidique à partir de plusieurs protocoles : un type maxiprep et un avec le kit qiagen spin miniprep.
J'ai ensuite réalisé une PCR avec le kit de ma Pfx (afin d'obtenir un insert à bouts francs pour pouvoir l'insérer dans mon vecteur d'expression), puis une gel d'agarose 1.5%.

et la au surprise je ne détecte aucunes bandes avec le kit qiagen, mais j'en détecte avec mon autre protocole (les bandes ne sont pas propres et très grosses... donc pas génial pour du séquencage et de la transfection). Nous avons donc cherhé pourquoi cela ne marche pas avec le kit qiagen..

je veux donc vérifié si c'est mon extraction qui n'a pas marché, je recommence ma PCR sur une suspension (= 50µl d'eau avec 2 ou 3 bactéries).

et la... j'ai deux bandes magnifiques propres et à la bonne taille...

Nous avons donc pensé que la quantité d'ADN était peut être inhibitrice à trop forte concentration, j'ai donc recommencé deux PCR à partir de mon extrait plasmidique :
- une avec ma Pfx et différentes quantité d'extrait 1,3,5,10µl pour 49,47,45,40µl de mix
- une avec la Raq Gold et les mêmes quantité d'extrait.

là j'ai obtenu des résultats avec la Taq montrant que la quantité d'ADN est inhibitrice à fortes doses mais aucuns résultats avec ma Pfx...

je ne sait donc plus quoi fair eet surtout je ne comprend pas pourquoi cette PCR ne veut pas fonctionné. (ce n'est bien sûr qu'un résumé des manips que j'ai effectuées....)

si jamais vous avez des idées je suis preneuse!!

merci d'avance

nanie

nous avons donc pensé que la quantité d'ADN
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[IngDr]

Bonjour,
- une avec ma Pfx et différentes quantité d'extrait 1,3,5,10µl pour 49,47,45,40µl de mix

ce qui correspond à quelle quantité d'ADN dans la PCR ? En général, 20-50ng suffisent largement.

[invite9a7a6874]

ce qui correspond pour 3µl à ~20ng/ml

[IngDr]

3µl à 20ng/ml (=20pg/µl) ? Soit 60pg utilisé pour la PCR ?
Dans ce cas, je te conseillerais d'utiliser quand même plus de matériel (essaye 20ng ou 50ng par PCR).
Car en partant de si peu d'ADN, tu risques de devoir augmenter ton nombre de cycle (d'ailleur t'es a combien de cycle d'amplif), ce qui est génant car dans ce cas la proba d'une mutation ponctuelle augmente.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9a7a6874]

j'ai 30 cycles
mais la quantité d'adn ne semble pas etre un probleme sauf à grande dose car le PCR marche avec l'utre protocole d'extraction (typa maxiprep) et sur la suspension bactérienne
et, dans ces deux cas j'ai mis 3µl d'extrait ou de suspension + 47µl de mix

[Yoyo]

SAlut

Moi je dirais qu'a partir ou tu arrives a amplifier ton fragment avec ta taq c'est bien.
Apres que la pfx marche ou pas, c'est probablement une question de sels.

YOyo

[invite9a7a6874]

ba le soucis de la taq c'est quelle ne donne pas de fragments à bouts francs... absolument nécessaire pour ma transfection...

[Yoyo]

ba le soucis de la taq c'est quelle ne donne pas de fragments à bouts francs... absolument nécessaire pour ma transfection...

Je suis bien d'accord, j'aurai bien un conseil.... utilise la phusion elle marche super bien, demande a MaliciaR

YOyo

[invite9a7a6874]

ouai mais après ça n'est pas moi qui décide de quelle enzyme utilser ^^

[Yoyo]

ouai mais après ça n'est pas moi qui décide de quelle enzyme utilser ^^

je me doute ,
tu peux aussi essayer de diminuer la temperature d'annealing et d'en augmenter le temps (genre 1mn au lieu de 30s). Apres si ca marche pas, tu n'auras pas d'autre choix que de changer d'enzyme.

YOyo

[IngDr]

j'ai 30 cycles
mais la quantité d'adn ne semble pas etre un probleme sauf à grande dose car le PCR marche avec l'utre protocole d'extraction (typa maxiprep) et sur la suspension bactérienne
et, dans ces deux cas j'ai mis 3µl d'extrait ou de suspension + 47µl de mix

Tu sous entends donc que tu as dosés l'ADN de ta suspension de bactos pour m'assurer que tu as la même quantité d'ADN que dans la PCR sur plasmide miniprep ? Tu dilues ton plasmide dans quoi pour arriver à 20ng/ml apres la maxiprep et la miniprep ? H2O, TE ? As tu vérifié les plasmides sur gel ?

Et si ca marche sur colonies isolées, pourquoi ne pas utiliser ces produits de PCR pour le clonage ?

[invite9a7a6874]

non je n'ai pas dosé ma suspension de bactérie par contre mais mes extraits car ce sont eux qui posent un problème
suite à l'extraction je dillue dans de l'eau, et oui j'ai verifie mon plasmide sur gel il est bien présente

pour mon clonage, c'est ce que j'ai décidé de faire, prendre mes produits pcr obtenus à partir de supsension. Mais tout de même le labo m'a acheté un beau kit qui coute quand meme assez cher, alors ca seriat bete de ne pas pouvoir l'utiliser

[IngDr]

A l'issu de ta mini et maxi, quelle est la concentration de ton vecteur ?
Ca doit être de l'ordre de 1mg/ml je pense.
Comment fais tu ta dilution pour arriver à 20pg/ml ? Par dilution en cascade (j'espère) ou par dilution dans un grand volume ?

pour ton kit, ne t'en fais pas, tu auras l'occasion de l'utiliser dans les étapes suivantes pour vérifier ton clonage et amplifier ton vecteur !