ARN et contaminants

[invite0052996b]

bonjour,
Je voudrais savoir si les "grosses patates sans trainées" que l'on voit sur gel d'agarose après extracton d'ARN sont de l'ADN génomique, de l'ARN dégradés ou de l'ARN avec des stucture secondaire. Merci à vous
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[piwi]

Faudrait un exemple de ce à quoi tu penses parce que là on ne voit pas trop la chose.

Cordialement,
piwi

[invite0052996b]

En fait ce sont des grosses bandes près des puits. il y a une migration de quelques mm sur gel d'agarose 1%.

[IngDr]

Et par rapport à une échelle de taille ca migre à combien ?
A priori si ca reste tres pres des puits, ca peut etre de l'ADN génomqiue. Toujours pas de traitement DNase ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0052996b]

nan, je n'ai pas encore utilisé de DNases. j'reste coincé sur cette manip. car j'voudrais comprendre ce que sont ces gros paquets. ça peut être de l'ARN dégradé, même s'il n'y a pas de smear? à priori ça peut être que de l'ADN ou de l'ARN. merci d'éclaircir cela.

[IngDr]

Si c'est dégradé c'est petit, donc ca migre plus rapidement, donc ca ne reste pas pres des puits.
Ensuite, pour tes manips sur gel, pense à mettre un marqueur de taille, c'est un controle indispensable pour pouvoir comparer la migration de tes échantillons avec quelque chose de connu (le marqueur). Cela te permet aussi de détecter tout problème de migration (pas assez ou trop migré par exemple)
Comme je pense que tu as quand même fait suffisement migré (voire trop si c'est de la manip dont tu parlais dans un post précédent) (le colorant bleu ayant migré jusqu'au 1/3-2/3 du gel. A l'inverse d'un gel de protéine, on ne fait jamais sortir le bleu sur un gel d'agarose), il n'est pas possible que ce ne soit que des ARN, car dans ces conditions (gel agarose 1%), il faudrait que tes ARN fassent plus de 20-30kb pour être cette pattate. Or ce n'est pas le cas, la majorité des ARN n'ont pas cette taille.

[invite0052996b]

donc à priori ces grosses bandes près des puits seraient de l'ADN? Sinon j'ai un doute mais lorsque l'on mesure la DO à 260, on détecte ADN et ARN en même temps donc même en ayant un bon rapport (près de 1.8) ça ne signifie pas qu'il n'y pas de contaminant ADN ? Ce rapport permet de dire juste s'il y a ou non des protéines. C'est bien ça? merci

[IngDr]

Oui c'est ca. Le rapport 260/280 te permet de voir si tu as des contaminants (protéine, phénol), et si ton culot est bien redisssous.