PCR et température d'hybridation

[invite79917c5c]

Bonjour !

Je travaille actuellement en zoologie moléculaire en tant que stagiaire (DUT 2eme année)
J'aimerais savoir pourquoi augmenter la température d'hybridation permet une bien meilleure hybridation des amorces.
En effet suivant le conseil de collègues, j'ai augmenter de deux degrés ma température d'annealing (de 52 (normalement correct pour mes amorces) a 54 °C). Résultat : je suis passé de smears à une bande (donc un résultat correct)
Seulement deux degrés ont donc fortement augmenter la stringence?
A quoi cela est du ? Merci

Cordialement, le nouveau : Allan 87
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[Alegs]

Bonjour et bienvenue alors!!
Moi je dirais que les températures les plus fortes sont les meilleures jusqu'à un certain niveau, pour les PCR, car il faut une dénaturation et ce sera plus efficace à mon avis à haute température, et on utilise d'ailleurs une bactérie qui puisse survivre à ces très hautes températures (80° mais j'ai peur de dire n'importe quoi).

Enfin moi je dis ça mais attendons l'avis de gens plus qualifiés

[invite79917c5c]

Salut merci de ta réponse !

Le truc c'est comme je suis très curieux j'aimerai savoir concrètement ce qui se passe en augmentant cette température. C'est à dire pourquoi les amorces on tendance à se fixer de manière plus spécifique (plus de 'mouvement' à température élevée?? )Et dans ce cas cela peut alors résoudre les problèmes de smears comme dans mon cas.

[MaliciaR]

Hello et bienvenue

J'aimerais savoir pourquoi augmenter la température d'hybridation permet une bien meilleure hybridation des amorces.
En effet suivant le conseil de collègues, j'ai augmenter de deux degrés ma température d'annealing (de 52 (normalement correct pour mes amorces) a 54 °C). Résultat : je suis passé de smears à une bande (donc un résultat correct)
Seulement deux degrés ont donc fortement augmenter la stringence?
A quoi cela est du ? Merci

Cordialement, le nouveau : Allan 87

C'est marrant, juste 2 degrées...?
Tu sais ce qu'est la Tm : la température à laquelle la moitié de ton ADN double-brin est sous formé simple-brin. La T°hybridation est donc celle où tes oligos (ADN simple-brin) s'hybrideront le mieux avec ta matrice. Si tu as, admettons, une hybridation de quelques nucléotides en 3' pas loins de ton autre oligo, voilà une bande... dont tu te fiches En revanche, si tu as une T°C plus élevée (pas de dizaines de degrées non plus, hein) tu "contraindras" ton primer à aller se fixer là où il faut. (Je ne sais pas si je suis claire, trop de preps aujourd'hui, trop d'EtOH )

Mais tu as des smears ou plusieurs bandes très proches?

Moi je dirais que les températures les plus fortes sont les meilleures jusqu'à un certain niveau, pour les PCR, car il faut une dénaturation et ce sera plus efficace à mon avis à haute température,

Oui, certes, mais rassure-toi : une étape de dénaturation est prévue à chaque cycle Là, on parle de T°C d'hybridation.

et on utilise d'ailleurs une bactérie qui puisse survivre à ces très hautes températures (80° mais j'ai peur de dire n'importe quoi).

Non, on utilise une polymérase! Rien à fiche de la bactérie, on veut une enzyme qui fasse une chaîne de nucléotides à partir d'une amorce : ça s'appelle une polymérase


Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[Alegs]

Moi dans mon cours pour les PCR il est indiqué les différents niveaux de chaleur adaptée pour chaque étape:

90° => dénaturation des 2 brins
55° à 60° => Hybridation (c'est ton étape en fait)
70° => extension

En fait ce que je disais tout à l'heure c'était pour la dénaturation et toi tu demandais pour l'hybridation, pardon!

Cette étape (généralement 2 à 60 secondes à 56-64°C) permet aux amorces sens et anti-sens de s’hybrider aux ADN matrice grâce à une température qui leur est thermodynamiquement favorable. Peu de brins d’ADN matrice peuvent s’hybrider (se lier) avec leur brin complémentaire, ce qui empêcherait la fixation des amorces, car ces dernières sont bien plus courtes et en concentration bien plus importante. Expérimentalement, il est constaté que la PCR fonctionne même avec une phase d’hybridation avec une température supérieure de quelques degrés au Tm théorique des amorces, probablement parce qu’elles interagissent déjà avec les polymérases, qui stabiliseraient leur hybridation à l’ADN matrice.

Moi j'ai dans mon cours que c'est la température idéale de reformation des ATGC, mais qu'elle varie un peu. Sinon j'ai que plus on augmente la température, plus la spécificité augmente mais l'efficacité diminue. Si on diminue la température, on a des contraintes chimiques moins fortes... Et pour l'efficacité, c'est en terme du nombre d'amorces.

C'est un peu flou je sais mais c'est très théorique de mon côté


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Edit: Salut MaliciaR! tu m'as devancé de quelques minutes

Non, on utilise une polymérase! Rien à fiche de la bactérie, on veut une enzyme qui fasse une chaîne de nucléotides à partir d'une amorce : ça s'appelle une polymérase

Taq polymérase, effectivement, aquaticus thermicus ou un nom du genre!

[piwi]

thermophilus aquaticus

Mais c'était presque ça.

[Alegs]

Effectivement, 'sont thermophiles quelque part
Mais au fait pour les PCR, on élève bien le nombre de copies au carré à chaque cycle?

[piwi]

Non.
Au mieux tu les doubles à chaque cycle.

1 2 4 8 16 ect.... La loi est en 2ⁿ

[MaliciaR]

Bou, NON au racisme anti-Archeae!

Il y a la très célèbre Pfu provenant de Pyrococcus furiosus (c'est une Euryarcheota extrêmophile) et sa chère dérivée Phusion, puis il y a Vent provenant de Thermococcus litoralis (Euryarchaota extrêmophile aussi).


Cordialement,

[invite79917c5c]

Merci pour toutes vos réponses !

Et oui j'ai la notion de Tm MaliciaR

Par contre j'ai des bandes très correctes et justement avant d'augmenter la température de deux degrés j'avais des smears. Et de deux degrés me paraissaient peut mais apparemment non, des que la température dépasse celle théorique pour l'hybridation des amorces, elles semblent alors contraintes à se fixer encore plus spécifiquement.

[MaliciaR]

Hello,

J'expliquais ce qu'est la Tm essentiellement pour Alegs

Je suis assez étonnée que tu aies un smear. As-tu refait la même PCR en parallèle encore une fois (avec T° hybridation = 52°C)? Je sais qu'une fois je n'avais pas de bande du tout, j'ai refait les choses en plus de changement de T° hybridation et j'ai eu mes bandes ce qui signifiait que j'avais oublié de mettre quelque chose
Puis, ton smear m'étonne : ce serait plutôt un souci de tampon, non? Parce que je veux bien que les oligos se fixent ailleurs que là où tu souhaites, mais ça donnerait des bandes de tailles différentes de celle qui t'intéresse, non? Parce que 2 degrés c'est un peu piti

Mais l'essentiel est que ça marche


Cordialement,

[Alegs]

Tu sais ce qu'est la Tm : la température à laquelle la moitié de ton ADN double-brin est sous formé simple-brin. La T°hybridation est donc celle où tes oligos (ADN simple-brin) s'hybrideront le mieux avec ta matrice. Si tu as, admettons, une hybridation de quelques nucléotides en 3' pas loins de ton autre oligo, voilà une bande... dont tu te fiches En revanche, si tu as une T°C plus élevée (pas de dizaines de degrées non plus, hein) tu "contraindras" ton primer à aller se fixer là où il faut. (Je ne sais pas si je suis claire, trop de preps aujourd'hui, trop d'EtOH )

Merci d'avoir précisé que c'était pour moi, je pensais que ça ne me regardait pas!! Heureusement parce qu'en fait cette notion est à la portée de ma compréhension!
En fait c'était plus le terme de "smear" qui m'effrayait (et m'effraie encore)

[invite79917c5c]

Merci d'avoir précisé que c'était pour moi, je pensais que ça ne me regardait pas!! Heureusement parce qu'en fait cette notion est à la portée de ma compréhension!
En fait c'était plus le terme de "smear" qui m'effrayait (et m'effraie encore)

En fait le terme de 'smear' est simplement la traduction du mot 'trainée/tache' en anglais.
Ca signifie en fait que tu obtient une trainée d'adn alors qu'avec une PCR tu amplifie normalement un fragment bien précis (et tu devrais donc avoir une bande (ou plusieurs si tu utilise plusieurs amorces) et non pas une trainée d'adn).

En tout cas je pense vraiment avoir fait correctement mon mix lorsque j'avais eu des smears..mais bon on est jamais sur de rien
Je pense dorénavant que je resterais quand même deux degrés de plus