Carte de restriction électrophorèse

[invite2e0bac3d]

Bonjour,
J'ai réalisée une digestion d'un plasmide bactérien inconnu afin de déterminer sa carte de restriction. Pour cela, je l'ai digéré avec des enzymes de restriction: BamHI et EcoRI. J'ai fait une digestion avec chacune des enzymes tampon E pour BamHI et tampon MC pour EcoRI et une avec les 2 dans le tampon MC (activité 75% pour bamhI et 100 pour ecorI). Après cette digestion g réalisé une éléctrophorèse. J'ai obtenu:
- pour bamhI 1 bande à 6000
- pour ecorI 2 bandes 2500 et 3500
- pour les 2 1 bande à 2500/3000
Je n'arrive pas a faire ma carte de restriction, je ne comprend pas cmt je peux obtenir 1 seule bande pour la double digestion. J'ai envisagé de hypothèses:
- BamhI et EcorI coupent au même endroit donc 1 bande
- la digestion est incomplète car mauvais champs de tampon
Aidez moi s'il vous plait, pensez vous que ces hypothèse soit correcte?
-----

[piwi]

Je crois que tu as manqué un peu de réflexion sur ce coup là.

Digestion simple: 6000 pb.
Donc le plasmide fait 6000 pb.

Digestion EcoRI: 2500 + 3500
On a toujours 6000 pb on est cohérent.

Digestion EcoRI + BamHI: 2500 + 3000 = 5500
Tiens il manque 500 pb? Il doit y avoir une bande faible que tu n'as pas vu dans le gel ^_^

Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

Bonjour,

Tu n'as fait aucune autre digestion? Je veux dire, ce serait peut-être plus fiable de croiser des résultats
Et puis, pas de contrôles...?

Je suis curieuse : qu'est-ce que ce plasmide inconnu que tu as sous la main et que tu ne caractérises que par une digestion avec deux enzymes...?


Cordialement,

[invite2e0bac3d]

En faite l'objectif de ce TP c'est d'effectuer la carte de restriction du plasmide c'est à dire trouver à quel niveau du plasmide sont situé les site de restriction de mes enzymes

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2e0bac3d]

Pour Piwi, merci mais j'ai du mal m'exprimer pour la double digestion je n'obtien qu'une seule bande située entre 2500 et 3000, c'est ca que je n'arrive pa à interprété sachant que la taille de mon plasmide est de 6000...

[MaliciaR]

Pour Piwi, merci mais j'ai du mal m'exprimer pour la double digestion je n'obtien qu'une seule bande située entre 2500 et 3000, c'est ca que je n'arrive pa à interprété sachant que la taille de mon plasmide est de 6000...

Est-ce que cette bande est de la même intensité que l'autre bande à 2.5 kb? (Faut pas te filer la réponse tout de suite, ce n'est pas intéressant ).

Sinon, vu le manque de contrôles et le choix des enzymes, ça sentait le TP


Cordialement,

[invite2e0bac3d]

A vrai dire, on ne voit pas grand chose sur mon electrophorèse. Mais il me semble que la bande issue de la double digestion est de même intensité que celle à 2,5kb. Théoriquement j'urais du obtenir les 2 meme bandes pour la double digestion que pour bamhI. Est ce que cela peut être due à l'efficacité du tampon que j'ai choi?

[MaliciaR]

Théoriquement j'urais du obtenir les 2 meme bandes pour la double digestion que pour bamhI. Est ce que cela peut être due à l'efficacité du tampon que j'ai choi?

Pourquoi? Visiblement, ton plasmide ne possède qu'un seul site BamHI puisque tu obtiens une seule bande. (Ou n'en possède pas du tout : on ne va pas trop envisager ça étant donné le manque de contrôles...).


Cordialement,

[invite2e0bac3d]

Oui je suis d'accor il n'y a qu'un seul site bamHI car 1 seul bande mais j'ai auusi 2 site ecoRI car jobtien de bandes après digestion. Ce que je ne compren pas c'est que je n'obtien qu'une bande lors de la double digestion, est-il possible alor que lors de cette double digestion les enzymes bamHI et ecoRI aient coupé au même endroit?

[MaliciaR]

Oui je suis d'accor il n'y a qu'un seul site bamHI car 1 seul bande mais j'ai auusi 2 site ecoRI car jobtien de bandes après digestion. Ce que je ne compren pas c'est que je n'obtien qu'une bande lors de la double digestion, est-il possible alor que lors de cette double digestion les enzymes bamHI et ecoRI aient coupé au même endroit?

Tu t'approches de la chose. N'oublie pas non plus qu'il te manque un bout de 500 pb
En revanche, un petit effort sur l'orthographe serait apprécié


Cordialement,

[invite2e0bac3d]

Alors pour être plus précise, j'ai tracé la courbe logPM=f(distance de migration)
J'obtiens alors:
- BamHI=6150 pb
- EcoRI= 3430 pb et 2700pb soit 6130pb
- double digestion= 3090 pb
En supposant que dans la double digestion mes 2 enzymes aient coupé au même endroit, je pense pouvoir multiplier 3090 par 2 soit 6180 pb pour la double digestion ce qui serait cohérent avec les autres résultats. Mais je ne comprends toujours par le résultat de cette double digestion, car selon moi j'aurais du obtenir les mêmes résultats que la digestion EcoRI sinon je ne peux pas trouver la carte de restriction de mon plasmide... Dans la double digestion si mon hypothèse (les 2 enzymes bamHI et ecoRI coupent au même endroit), j'aurais 2 fragments identiques dans mon plasmide ce qui ne coincide pas avec la digestion de EcoRI. Et pourquoi mes 2 enzymes auraient-elles coupées au même endroit...

[MaliciaR]

Salut,

Alors pour être plus précise, j'ai tracé la courbe logPM=f(distance de migration)
J'obtiens alors:
- BamHI=6150 pb
- EcoRI= 3430 pb et 2700pb soit 6130pb
- double digestion= 3090 pb
En supposant que dans la double digestion mes 2 enzymes aient coupé au même endroit, je pense pouvoir multiplier 3090 par 2 soit 6180 pb pour la double digestion ce qui serait cohérent avec les autres résultats.

Je pensais que ta bande était à 2.5 - 3 kb Mais le raisonnement est correct.

Dans la double digestion si mon hypothèse (les 2 enzymes bamHI et ecoRI coupent au même endroit), j'aurais 2 fragments identiques dans mon plasmide ce qui ne coincide pas avec la digestion de EcoRI. Et pourquoi mes 2 enzymes auraient-elles coupées au même endroit...

Bonne remarque (soulignée) Tu tournes autour de la réponse, vraiment! A partir du moment où les résultats expérimentaux ne confortent pas une hypothèse, on modifie l'hypothèse

N'oublie pas ça :

Digestion EcoRI + BamHI: 2500 + 3000 = 5500
Tiens il manque 500 pb?

Donc, si deux enzymes ne coupent pas au même endroit, mais coupent tout de même au sein de la séquence et la conséquence est qu'il me manque un bout de 500 pb, je pense à quoi?


Cordialement,

[invite2e0bac3d]

Franchment sur ce coup-là je bloque, j'ai recherché dans mon cours de biotechnologie mais je ne vois pas car quand une enzyme de restriction clive l'ADN, elle ne fait disparaitre aucun nucléotide. Ma bande manquante est peut-être trop faible pour que je puis la voir sur mon éléectrophorèse. (ou alors ma bande manquante est partie du gel car la migration était trop lente)
En tout cas, merci de votre aide

[invite2e0bac3d]

Sinon cela peut-être du à "l'activité star" de bamHI qui est capable de reconnaitre les sites de EcoRI mais dans ce cas là, on en revient toujours au même, pour la double digestion, j'aurais dut obtenir les mêmes fragments que pour ceux de ecoRI

[Yoyo]

salut

franchement faudrait qu'on puisse voir le gel pour se faire une idée.

Yoyo

[invite2e0bac3d]

Bonjour, voila je vous joint mon gel électrophorèse. Les bandes ont été rajoutées au stylo car non visibles sur le gel mais présente à la caméra.
1er puits: marqueur de taille
2ème puits: bamHI
3ème puits EcoRI
dernier puits: double digestion
Merci

[Zellus]

Salut,

Clairement on ne voit pas grand chose sur ton gel. Vu comme les bandes de hauts poids moléculaires sont peu visibles, on peut penser qu'il y en a de faible PM que l'on ne voit pas. D'autant que le bas de ton gel est blanc en partie ...
Je suppose que tu n'as pas la possibilité de refaire un gel vu que c'est un TP ?

pour la double digestion, j'aurais dut obtenir les mêmes fragments que pour ceux de ecoRI

Non tu as BamHI qui coupe aussi !