Protocole pour une ligature + tranformation ?

[invite09d67ed7]

Holà todo el mundo !

Voilà, je continue gaiement mon stage à Barcelone, mais maintenant j'ai un petit souci : je dois faire une construction plasmidique toute simple, donc digestion de l'insert et du vecteur par 2 enzymes de restriction, ligature, et puis transformation de bactéries E. coli.

Le seul souci c'est que personne dans mon labo ne semble avoir de protocole pour ces manipulations. J'ai bien une idée des manips à faire, mais pour ce qui est des quantités à digérer et à ligaturer, de si je dois faire un gel ou non à chaque étape et tout et tout (sachant que mon insert est en faible concentration, moins de 7 ug/uL ! Grâce à mon super kit de gel extraction dont je me citerai pas la marque !!)

Voilà, donc pour les infos : mon insert fait environ 700 pb, et je vais utiliser comme vecteur le plasmide pBluescript SK, et je sais quelles enzymes je vais utiliser. Si vous avez une idée de protocole, des quantités, des temps d'incubation et tout je suis preneuse !!

Merci d'avance à tous !
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[piwi]

Première question à se poser. Tes enzymes sont elles compatibles entre elles? Si tu les as du même fournisseur (le plus simple quand même) tu peux aller voir leur charte d'enzyme de restriction en générale disponible sur internet. Choisi bien ton buffer.
Si tu as peu d'insert ce que tu peux faire c'est l'amplifier par PCR (les amorces portant les sites de restriction voulu).


Tous les buffers sont concentrés 10X. Il ne faut jamais mettre plus de 1/10 du volume final en enzyme. En général je digère dans 50µl avec 5µl de buffer et 5µl d'enzyme. Vérifie bien qu'il ne faille pas ajouter de BSA. Certaines enzymes le nécessitent. Vérifie aussi la température d'activité maximal; dans l'immense majorité des cas c'est 37°C mais parfois on a des surprises.
Les ADNs maintenant: l'insert est parfois limitant. Mettez en simplement le maximum. Si vous avez travaillé par PCR vous en aurez beaucoup et vous n'aurez pas à vous inquiéter. Pour le plasmide en général c'est pas un souci vu que l'on peut l'amplifier facilement par midi/maxiprep (il vaut mieux éviter de travailler avec les miniprep qui sont plus sales en général). En prinicpe, j'en digère 2,5-5µg de sorte à être à l'aise pour toutes les étapes.
Les digestions se font pendant 1h ou deux.

Vous avez deux cas de figure. Les enzymes sont compatibles, vous pouvez procéder en 1 étape avec 2,5µl de chacune des enzymes.
Les enzymes ne sont pas compatibles et là ca se complique un peu.

1. vous préparez un buffer intermédiaire qui va vous permettre de transformer votre milieu de réaction 1 en un milieu de réaction pour l'enzyme 2. C'est un peu chiant. Dans ces cas là je passe à 60 ou 75µl final.
2. Vous purifiez (phenol/chloroforme ou encore un kit de purif; le nucleospin extract II est simple et efficace par exemple) votre ADN et vous recommencez dans 50µl

A chaque étape, pensez à faire migrer 200/300ng du plasmide pour vous assurer que l'enzyme a coupé. En contrôle on fait migrer la même quantité de plasmide non coupé. A la seconde étape vous pouvez aussi éventuellement ajouter du plasmide non coupé que vous digèrerez avec la seconde enzyme. Lui aussi devra être linéarisé, ce qui vous permettra d'être certain que votre enzyme coupe. Vous devrez vous fier à ces contrôles pour l'insert.
Une fois ceci fait vous purifiez tout cela en reprenant dans un plus petit volume histoire de concentrer un peu (30µl par exemple).
Il est important pour la ligation de faire migrer cote à cote le plasmide et l'insert digérés (2µl par exemple) afin d'évaluer les concentrations de plasmide et d'insert.

La ligation se fait dans de petits volumes, en principe 10µl. Dans le milieu de ligation il vous faut mettre le buffer de la ligase (en principe concentré 10X). De l'enzyme. Sa concentration peut varier mais en général en mettre 1µl est suffisant. Enfin il est très important de ne pas oublier de mettre de l'ATP! L'ATP n'est pas très stable. Évitez d'utiliser de vieux stock et protégez bien le votre des écarts de température. On met 1µl de 25mM stock.
Ensuite mettez vos ADN de sorte d'avoir grossièrement la même quantité (on parle en quantité pas en masse) des uns et des autres (Par exemple 500ng de plasmide; la photo vous y aidera). Completez si besoin avec de l'eau et là deux écoles:

1. 1 à plusieurs heures sur un coin de paillasse. Par exemple, on lance la ligation le matin et on transforme le soir
2. On lance la ligation le soir sur toute la nuit à 4°C

La transformation dépendra du type de bactéries compétentes dont vous disposez. Je n'entre pas dans le détail.
En général voici ce que je fais:
transformation avec le plasmide linéarisé histoire de vérifier le taux de plasmide non coupé.
transformation avec l'insert.
transformation avec la ligation.
Pour chacune des conditions j'étale 1/10 des bactéries sur une boite et 9/10 sur une autre.

Cordialement,
piwi

[invite09d67ed7]

Merci pour tous ces détails ! J'y vois maintenant un peu plus clair.

Seul soucis c'est que mon insert est déjà un produit de PCR que j'ai eu du mal a obtenir, j'ai déjà essayé de le réamplifier mais ça m'a donné quelque chose de plutôt sale et j'ai dû perdre 300 pb ! C'est en fait un micro ARN artificiel que j'ai du faire par PCR, donc je suis plutôt coincée à ce niveau là. Et dans mon premier message, je me suis trompée, je n'ai pas 7ug mais 7ng/uL pour 50 uL finaux.

J'ai trouvé des enzymes compatibles (celles que j'avaient choisies avant ne l'étaient pas au niveau de la BSA, merci pour ce détail !)

Bon, ben... il ne me reste plus qu'à me mettre au travail ! Merci encore pour ta réponse, piwi, je vous tiens au courant de l'évolution des choses ^^.

Hasta luego chicos !

[MaliciaR]

Salut,

Si tu as des quantités si basses, tu peux essayer de concentrer par lyophylisation. Tu fais sécher ton produit de PCR et tu resuspends dans moins d'eau, ce qui fait que tu auras une concentration en insert supérieure
Est-ce que tu as cette quantité après purification de ton produit PCR? Parce que les kits classiques de purif sur colonne font perdre environ 20% du matos de départ Vaut mieux le prendre en compte

Sinon, as-tu essayé plusieurs protocoles de PCR (T°C différentes, polymérases différentes)?


Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite09d67ed7]

Oui, j'ai purifié mon insert comme suit :
- PCR
- migration sur gel (et non, je n'arrive pas à obtenir qu'une seule bande :/)
- découpage de la bande
- purification par QIAQUICK Gel Extraction, magnifique kit qui me fait perdre presque tout mon ADN
Et voilà. Je ne peux pas vérifier ma purif par électrophorèse (pas assez d'ADN), je dois faire confiance et avoir la foi !

Et pour les paramètres de la PCR, j'en ai essayé plusieurs, oui, et j'ai pris le protocole de PCR donnant les meilleurs résultats ^^.

Merci pour ta réponse, Malicia

[MaliciaR]

Salut,

Je n'ai jamais fait de vérification de purif Il suffit que tu aies tous les contrôles possibles au moment de la ligation pour être sûr(e) que ce que tu obtiens est bien ce que tu veux Donc, si je comprends bien, tu as quantifié tes produits de PCR purifiés...

Sinon, as-tu pensé à vérifier si tes soucis de PCR ne viennent pas des primers? Tu purifies la bande sur gel parce que tu as des amplicons indésirables, est-ce cela? Mais tu découpes et purifies une bande que tu as visualisée avec du BET?


Cordialement,

[invite09d67ed7]

C'est exactement ça !

[MaliciaR]

C'est exactement quoi? Tu purifies après le BET...? Ou tu nous donnes la quantité après purif?

Tu veux faire une ligation et transformation dans quel but?


Cordialement,

[invite09d67ed7]

Oui, je purifie après le BET, parce que sinon je vois pas bien comment j'aurais pu voir ma bande et la découper. Donc vous avez ma concentration d'ADN après la purif (cf un topic que j'ai lancé il y a de cela un mois qui faisait part de mes petites quantités d'ADN après purif grâce à un kit maudit). Ensuite, je veux liguer et transformer parce que j'en ai besoin pour cloner, amplifier mon fragment (qui est je le rappelle un amiRNA bien chiant à obtenir déjà par PCR) pour ensuite transformer des plantes via Agrobacterium tumefaciens (dans lequel j'aurai transféré mon fragment bien entendu).

Une autre question pour piwi : quelle quantité d'ADN ai-je besoin pour la ligature (vecteur et insert) ?

Gracias.

[MaliciaR]

Oui, je purifie après le BET, parce que sinon je vois pas bien comment j'aurais pu voir ma bande et la découper.

Beh ce que fait un collègue c'est qu'il dépose la même chose dans 2 puits : il découpe son gel, le révèle, puis il met à côté et découpe là où doit se trouver la bande sur le puits non soumis au BET. Ce qui lui évite de ramasser les mutations introduites par le BET...

(...)pour ensuite transformer des plantes via Agrobacterium tumefaciens (dans lequel j'aurai transféré mon fragment bien entendu).

Donc, tu veux in fine transformer des Agrobacterium avec ton plasmide recombinant?


Cordialement,

[invite09d67ed7]

Non, je ne vais pas transformer Agro avec une construction pBSK, mais avec une autre construction sur le plasmide T qui contiendra le fragment que j'aurai amplifié sur E. coli. Ce plasmide servira ensuite à transformer mes plants

[piwi]

Une autre question pour piwi : quelle quantité d'ADN ai-je besoin pour la ligature (vecteur et insert) ?

En principe, pas beaucoup. J'ai parlé de 500ng.
Personnellement je coupe 5µg disons en deux étapes. Donc deux purifs pour lesquelles j'estime mes pertes à 10% pour chacune.
Il me reste donc en sortie de purif 5µg --> 4,5µg --> 4,05µg.
Je reprends dans 30µl: 135ng/µl.
En principe j'en mets 2 à 4µl selon le rendement de ma PCR. Ce qui nous fait donc entre 270ng et 540ng. L'ordre de grandeur que je donnais à la louche tombe donc pile poil dans ce que je fais effectivement.

Si vous vouliez être précis il vous faudrait être equimolaire. 1 vecteur pour 1 insert. La quantité en masse va donc varier en fonction du plasmide et de l'insert. Le plus simple est de jauger à la louche à partir d'une photo.

Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

C'est bien ce qu'il me semblait Tu vas faire le transfert par recombinaison ou ...?

Sinon, concernant les quantités insert/plasmide, je mets généralement un rapport de quantité 3:1. Par exemple, une de mes ligations est du genre : un plasmide qui fait 5,4 kb, je choisis d'en mettre 60 ng; un insert qui fait 1,3 kb. Si je veux être en conditions 3(insert) : 1(plasmide), je mets 45 ng de l'ADN d'insert.


Cordialement,


P.S. Grillée par Piwi

[invite09d67ed7]

J'ai pas compris comment tu asd calculé ton rapport, Malicia ...

Sinon, le transfert je ne sais pas encore comment je vais le faire, on ne m'en a pas parlé.

Mais il faut purifier après la digestion c'est bien ça ? Comment je fais en gros ? Un kit ? quelque chose ?

[piwi]

Tout dépend de tes vecteurs.
Normalement on utilise deux vecteurs avec des gènes de résistance à un antibiotique différent.
Tu ouvres tes 2 plasmides avec les mêmes enzymes de restriction qui sortent ton insert. Tu te retrouves avec deux plasmides ouverts et un insert dans le même tube. Tu ligues. Tu auras donc normalement certains de tes nouveaux plasmides ouverts qui auront intégrés l'insert.
Tu transformes et tu sélectionnes avec l'antibiotique dont la résistance est conférée par ton nouveau vecteur. Du coup, si tous tes plasmides étaient linéarisés tu n'auras sélectionné que tes nouveaux plasmides recombinants. Sinon (le plus probable) il faudra faire un petit screen PCR pour les retrouver.

Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

J'ai pas compris comment tu asd calculé ton rapport, Malicia ...

C'est mieux avec une petite formule, je suis d'accord

,

les tailles étant en kb, i = insert, v = vecteur.



Cordialement,

[Zellus]

Salut,

Juste pour info, j'utilise un kit de Takara pour la ligation et ils disent de mettre 0,03 pmol de vecteur pour 0,03 à 0,3 pmol d'insert. Et j'incube à 16°C pendant 30 minutes. Une troisième école donc piwi .

Mais il faut purifier après la digestion c'est bien ça ? Comment je fais en gros ? Un kit ? quelque chose ?

Oui, il vaut mieux purifier après digestion parce que tes enzymes et le tampon risquent de gêner la ligation. Moi je purifie avec le même kit de Promega que pour purifier les PCR sur gel. Mais y a toujours des pertes ...

Cordialement,
Zellus

[Psedonyme]

Bonjour a tous,

J'apporte ma contribution, pour corriger un détail :

J'ai trouvé des enzymes compatibles (celles que j'avaient choisies avant ne l'étaient pas au niveau de la BSA, merci pour ce détail !)

Certaines enzymes necessitent l'ajout de BSA dans le tampon, mais la BSA ne gène l'activité d'aucune enzyme de restrction. Donc si tu as une enzyme necessitant BSA et pas l'autre, pas de souci!!

Voila, j'ai mis ma pierre a l'edifice^^

[invite09d67ed7]

Ahh merci, je ne savais pas que la BSA ne gênait pas

Bon, j'ai découpé mon vecteur et mon insert :
- 4,5 ug de vecteur
- tout mon insert, parce que j'en avais pas des masses quelque chose du genre 20 ng voire un peu plus.

J'ai tout fait migrer sur un gel 1%, et mes fragments font bien la taille voulue (même si mon insert, faut y regarder à 3 fois pour pouvoir le distinguer, mais il est là !)

J'ai découpé les bandes et j'ai purifié mes ADN grâce à mon super kit de la mort. Pour le vecteur, j'ai recouvert 16% de l'ADN que j'avais digéré au départ (je n'ai pas voulu prendre le risque de doser mon insert, j'en ai déjà très peu !)

Maintenant, je vais passer à la ligature, la grande question étant combien vais-je mettre de vecteur pour le peu d'insert que j'ai récupéré (que je n'ai pas dosé d'ailleurs) ?

Je vous tiens au courant, et vous ferai une photo si vous êtes sages

Adeu !

[MaliciaR]

Salut,

Je ne comprends pas pourquoi tu as dû migrer sur gel après la digestion de ton insert... Tu digères les extrémités ou tu t'attends à avoir deux bouts distincts (courure ailleurs)?


Cordialement,

[gorben]

Ahh merci, je ne savais pas que la BSA ne gênait pas

Bon, j'ai découpé mon vecteur et mon insert :
- 4,5 ug de vecteur
- tout mon insert, parce que j'en avais pas des masses quelque chose du genre 20 ng voire un peu plus.

J'ai tout fait migrer sur un gel 1%, et mes fragments font bien la taille voulue (même si mon insert, faut y regarder à 3 fois pour pouvoir le distinguer, mais il est là !)

J'ai découpé les bandes et j'ai purifié mes ADN grâce à mon super kit de la mort. Pour le vecteur, j'ai recouvert 16% de l'ADN que j'avais digéré au départ (je n'ai pas voulu prendre le risque de doser mon insert, j'en ai déjà très peu !)

Maintenant, je vais passer à la ligature, la grande question étant combien vais-je mettre de vecteur pour le peu d'insert que j'ai récupéré (que je n'ai pas dosé d'ailleurs) ?

Je vous tiens au courant, et vous ferai une photo si vous êtes sages

Adeu !

Salut,

En imaginant que ta perte est la meme lors de la purif entre le vecteur et l'insert, il te reste en theorie 3.2 ng d'insert... donc en pratique, rien du tout... jettes tout et recommence ! Tu vas galerer pour cloner un truc que tu n'as meme plus.
Le kit QiaExII est tres tres bien pour purifier a partir d'un gel (c'est le mieux que j'ai pu tester parmis... pleins). Ensuite tu fais ta double digestion, mais sans trop forcer sur les enzymes (1 ul pour 50 ul final c'est la ou l'enzyme est la plus efficace). Si ta concentration est trop faible, ne purifie pas, inactive juste les enzymes. Garde un ratio molaire 3/1 pour la ligation (5/1 si c'est des bouts francs), c'est le mieux.

Ce que tu peux faire aussi, c'est du Tcloning. Tu amplifies ton fragment, tu purifies sur gel et tu clones direct dans un plasmide. Ensuite tu reutilises ce plasmide comme template pour faire une PCR qui marche du feu de dieu et avoir 2 Kg d'insert

Attention a la ligase, dans le tampon il y a de l'ATP qui est tres fragile. Si le tamponi est vieux ou si il a ete congele/decongele souvent, il te faut une nouvelle enzyme (ou alors rajouter un peu d'ATP mais... bof bof) !

A+

[invite09d67ed7]

Coucou les gens !

Bon première réponse, j'ai fait migrer mon digestat pour virer les extrémités que je ne veux pas, et aue mon insert (et mon vecteur) soient plus purs.

J'ai recalculé la quantité d'insert que j'avais au départ : environ 150ng. Mais en fait comme notre machine a faire des photos de gel d'électrophorèse est un peu fatiguée, on ne voyait presque rien sur la photo, même pour le marqueur de poids moléculaire ! Donc si j'ai bien fait mes calculs à la fin de la digestion et de la purification sur gel, j'ai environ 20 ng dans 10uL d'eau ce qui me semble suffisant pour faire ma ligature si j'utilise la formule de MaliciaR.

Ah oui, et j'ai dû déphosphoryler mon vecteur aussi. Je sais que c'est pas vraiment la peine quand on digère avec 2 enzymes différentes, mais ma maître de stage semblait y tenir, au cas où une des 2 enzymes n'aurait pas bien coupé (cela ne peut pas se voir sur un gel). Alors après je sais qu'il y a le système blanc bleu dans ces cas là si seulement une des enzymes a coupé, mais bon... Je vais pas me mettre à dos la chef

Du coup pour faire ma ligature (avec le kit de Roche T4 ligase tout neuf que j'ai débusqué hier et conservé sauvagement à l'abris des autres personnes du labo), j'ai fait :
- 10 uL d'insert, donc tout en gros
- 1,5 uL de vecteur (donc en gros 36 ng) => rapport molaire 1:3
- 1,5 uL de Buffer
- 1,5 uL de T4 DNA Ligase
- 0,5 uL d'eau
Et tout ça a 4 degrés toute la nuit (la deuxième école de piwi^^).

Ensuite ce matin j'ai transformé mes bactéries compétentes, là elles sont mises à pousser sur des boîtes avec ATB, IPTG et X-Gal. On va voir ce que ça donne !

Je suis d'accord que ma manip n'a pas beaucoup de chances de fonctionner. Au début on était partis pour faire du Tcloning mais je ne sais pas pourquoi la chef a dit que c'était mieux de faire ça dans pBSK :s. En tout cas, tout cas ça n'est qu'un essai, et si ça ne fonctionne pas, on fera un Tcloning comme prévu.

Merci beaucoup à tous !!

Adios !