Criblage d'une banque d'ADNc

[invitefdfa7a92]

Salut tout le monde
je cherche à comprendre quel est l'intérêt de cette méthode
si on cherche un gène d'intérêt à partir d'un ARNm il suffit de synthétiser son ADNc pas besoin de toute une banque d'ADNc et le reste
quand on cherche un gène d'intérêt il y a le truc d'intérêt--->la protéine et donc à partir de la protéine on trouve toutes fois le gène correspondant et c'est facile de connaitre la protéine, il suffit d'utiliser la northern blots

je ne comprend pas pourquoi on démarre de milliers d'ARNm puis leurs ADNc en utilisant ensuite des phages pour avoir un clonage et à la fin utiliser des protéine ou des anti corps pour séparer chaque ADNc recombinants
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[IngDr]

Une partie de l'explication se trouve dans le fait qu'il y a 10 ans de cela, les génomes n'étaient pas séquencés entierement.

Une autre partie de l'explication réside dans l'application de la banque d'ADNc. Tu auras toujours besoin d'une telle banque pour des cribles d'intéraction, de fonction, etc...

[invitefdfa7a92]

Une autre partie de l'explication réside dans l'application de la banque d'ADNc. Tu auras toujours besoin d'une telle banque pour des cribles d'intéraction, de fonction, etc...

je pense qu'on utilisera une sonde radioactif ou des puces a ADN pour les intéractions et les fonctions..

[piwi]

Pas compris en quoi une sonde radioactive remplace un crible. C'est un moyen de cribler pas une technique en soit.
Sinon les puces à ADN ne donnent pas la même chose qu'un crible, là encore je ne vois pas vraiment le point.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitefdfa7a92]

Pas compris en quoi une sonde radioactive remplace un crible. C'est un moyen de cribler pas une technique en soit.
Sinon les puces à ADN ne donnent pas la même chose qu'un crible, là encore je ne vois pas vraiment le point.

Cordialement,
piwi

je parlais des fonctions et des intéractions si on veut par exemple savoir quelle sont les protéines qui s'expriment dans X condition on peut le savoir à partie des ARNm marqués dans les deux conditions différemment (a jeûn et nourris, par exemple) et avec une puce à ADN on peut voir les intéractions pareille pour la fonction sauf quand utilise le northern blots(avec la sonde radioactifs)
sinon pourriez vous m'éxpliquer votre point de vue!
en tout cas j'ai pas encore compris pour ma question! pourriez vous me donner un exemple pourquoi on utilise le criblage d'une banque d'ADNc, peut être ça m'aiderai à comprendre

[MaliciaR]

si on cherche un gène d'intérêt à partir d'un ARNm il suffit de synthétiser son ADNc pas besoin de toute une banque d'ADNc et le reste

Je ne comprends pas trop d'où tu tires la certitude absolue que l'ARNm d'un gène est si facile à obtenir...

quand on cherche un gène d'intérêt il y a le truc d'intérêt--->la protéine et donc à partir de la protéine on trouve toutes fois le gène correspondant et c'est facile de connaitre la protéine, il suffit d'utiliser la northern blots

Tu révèles des protéines en Northern, toi?
Comment est-ce que tu fais pour trouver la séquence précise d'un gène à partir d'une protéine sinon? Je doute fortement qu'on soit capables de produire les doigts dans le nez des anticorps contre n'importe quelle protéine (et à condition d'avoir déjà produit la protéine, ce qui est loin d'être une mince affaire...).


Cordialement,

[invitea069fc56]

Salut tout le monde
je cherche à comprendre quel est l'intérêt de cette méthode
si on cherche un gène d'intérêt à partir d'un ARNm il suffit de synthétiser son ADNc pas besoin de toute une banque d'ADNc et le reste
quand on cherche un gène d'intérêt il y a le truc d'intérêt--->la protéine et donc à partir de la protéine on trouve toutes fois le gène correspondant et c'est facile de connaitre la protéine, il suffit d'utiliser la northern blots

je ne comprend pas pourquoi on démarre de milliers d'ARNm puis leurs ADNc en utilisant ensuite des phages pour avoir un clonage et à la fin utiliser des protéine ou des anti corps pour séparer chaque ADNc recombinants

Je crois aussi que l'utilité des banques ADNc est encore moindre avec la variances des techniques de PCR. Or, si tu as besoin d'un gène, il suffit de désigner des primers puis d'essayer de l'amplifier à Partir de l'ADN génomique ou une population des RNAm synthétisée par la reverse transcriptase.
La banque d'ADNc reste utilise dans les cas précis (condition ou stade donné) où cette banque a été établie car elle contiendra les transcrits exprimés dans la condition appliquée.

[invitefdfa7a92]

Tu révèles des protéines en Northern, toi?

non je voulais dire que si on veut chercher un gène d'une protéine d'intérêt, c'est qu'on connais cette protéine.
laisse tomber pour la northern, ça change rien dans l'histoire, puisque la méthode du criblage d'une banque d'ADNc on l'utilise quand on connait quelque chose et on veut le cribler.

Comment est-ce que tu fais pour trouver la séquence précise d'un gène à partir d'une protéine sinon? Je doute fortement qu'on soit capables de produire les doigts dans le nez des anticorps contre n'importe quelle protéine (et à condition d'avoir déjà produit la protéine, ce qui est loin d'être une mince affaire...).

Cordialement,

de toute les façon à la fin de cette méthode on utilise soit des anti-corps de la protéine recherchée pour le criblage ou des olygonucléotides dégénérés de cette protéine.

Je crois aussi que l'utilité des banques ADNc est encore moindre avec la variances des techniques de PCR. Or, si tu as besoin d'un gène, il suffit de désigner des primers puis d'essayer de l'amplifier à Partir de l'ADN génomique ou une population des RNAm synthétisée par la reverse transcriptase.
La banque d'ADNc reste utilise dans les cas précis (condition ou stade donné) où cette banque a été établie car elle contiendra les transcrits exprimés dans la condition appliquée.

exactement tout à fait d'accord.
ce qui me dérange dans cette methode c'est son intérêt, on peut très bien faire cette banque d'ADNc d'un tissu précis et dans une période précise pour chercher un ADNc précis sans passer par des milliers de phages avec des manipulations délicates puis l'étalage sur plusieurs boite ......je pense qu'on pourrait directement étaler ces ADNc dans des boite avec la géllose molle puis faire un filtre de nylon pour avoir le transfert et travailler dans le propre ensuite la fixaton des olygonucléotides dégénérer, saturation, hybridation, lavage et autoradiographie.
voilà donc on utilise le début et la fin de cette méthode. pourquoi manipuler des phages.. les rendre recombinés ex.... ?????
je pense depis hier , j'ai fait quelque progrés dans la compréhension lol mais cette question me dérange

[IngDr]

voilà donc on utilise le début et la fin de cette méthode. pourquoi manipuler des phages.. les rendre recombinés ex.... ?????
je pense depis hier , j'ai fait quelque progrés dans la compréhension lol mais cette question me dérange

Tu veux faire comment pour rentrer efficacement ta banque dans les Bacteries pour l'amplifier ? C'est quoi ton histoire de déposer un cDNA sur de la gélose ? Tu crois qu'un cDNA est doué de replication autonome ex vivo ?

Et puis, c'est facile maintenant avec les connaissances du génome de choisir les amorces pour faire la RT, mais sans cela, comment être sur que ton cDNA est entier, qu'il est bien splicé, etc... En outre, si tu veux faire une recherche par homologie de séquence, l'utilisation de la banque était la seule solution pour trouver tous les variants de splicing, gènes homologues, etc...

[invitea069fc56]

exactement tout à fait d'accord.
ce qui me dérange dans cette methode c'est son intérêt, on peut très bien faire cette banque d'ADNc d'un tissu précis et dans une période précise pour chercher un ADNc précis sans passer par des milliers de phages avec des manipulations délicates puis l'étalage sur plusieurs boite ......je pense qu'on pourrait directement étaler ces ADNc dans des boite avec la géllose molle puis faire un filtre de nylon pour avoir le transfert et travailler dans le propre ensuite la fixaton des olygonucléotides dégénérer, saturation, hybridation, lavage et autoradiographie.
voilà donc on utilise le début et la fin de cette méthode. pourquoi manipuler des phages.. les rendre recombinés ex.... ?????
je pense depis hier , j'ai fait quelque progrés dans la compréhension lol mais cette question me dérange

Et encore, même si on veut les ADNc d'une condition précise, on a qu'extraire les RNA totaux et les transfromer en RNA messager puis synthétiser les ADNc et le tour est joué !
C'est fastidieux de faire une banque ADNc pour une utilité pas forcément introuvable par la PCR.

[invitea069fc56]

Tu veux faire comment pour rentrer efficacement ta banque dans les Bacteries pour l'amplifier ? C'est quoi ton histoire de déposer un cDNA sur de la gélose ? Tu crois qu'un cDNA est doué de replication autonome ex vivo ?

Et puis, c'est facile maintenant avec les connaissances du génome de choisir les amorces pour faire la RT, mais sans cela, comment être sur que ton cDNA est entier, qu'il est bien splicé, etc... En outre, si tu veux faire une recherche par homologie de séquence, l'utilisation de la banque était la seule solution pour trouver tous les variants de splicing, gènes homologues, etc...

AVec les banques des séquences complètes des génomes, on peut aussi utiliser le BLAST pour trouver des gènes homologues, variants du même gènes ("splicés")....etc.
Tu le sais d'ailleurs certainement que c'est le cas pour construire les arbres phylogéniques et composer les familles multi-génes !

[invitefdfa7a92]

Tu veux faire comment pour rentrer efficacement ta banque dans les Bacteries pour l'amplifier ? C'est quoi ton histoire de déposer un cDNA sur de la gélose ? Tu crois qu'un cDNA est doué de replication autonome ex vivo ?

comment être sur que ton cDNA est entier, qu'il est bien splicé, etc...

je cherche simplement pas de l'amplifier j'irai droit au but c'est de cribler parmi ces ADNc celui que je cherche qu'il soit présent ou non dans Xcondition.
pour est-ce que l'ADNc est entier ou pas, même la méthode du ciblage avec des phages n'y peut rien puisque c'est les ADNc du dépare qui seront recombinés avec l'ADN des phages.

[MaliciaR]

AVec les banques des séquences complètes des génomes, on peut aussi utiliser le BLAST pour trouver des gènes homologues, variants du même gènes ("splicés")....etc.
Tu le sais d'ailleurs certainement que c'est le cas pour construire les arbres phylogéniques et composer les familles multi-génes !

Ah, l'enthousiasme des jeunes!

Tu devrais savoir que :
* peu de génomes sont séquencés (peu en comparaison avec le nombre d'espèces vivantes existant);
* peu de génomes séquencés sont complètement assemblés et correctement annotés;
* BLAST est un programme informatique auquel tu fixes les paramètres. Donc, il ne te sortira pas les mêmes choses si tu changes des paramètres.

Sinon, que vient faire la phylogénie dans un questionnement sur les banques d'ADNc et où est son utilité concernant le criblage?

Pourquoi s'obstiner à ne pas comprendre l'intérêt d'un criblage?

[MaliciaR]

pour est-ce que l'ADNc est entier ou pas, même la méthode du ciblage avec des phages n'y peut rien puisque c'est les ADNc du dépare qui seront recombinés avec l'ADN des phages.

C'est bête, hein, quand on aura tout le génome d'une bactérie dans une banque, on aura droit à tous les gènes : exprimés, non exprimés, codant une protéine, ne codant pas de protéines, etc.

P.S. L'ADN bactérien ne recombine pas à proprement parler avec le génome du phage... C'est mieux à faire gaffe au vocabulaire et à la clarté d'expression tout de même

[invitefdfa7a92]

C'est bête, hein, quand on aura tout le génome d'une bactérie dans une banque, on aura droit à tous les gènes : exprimés, non exprimés, codant une protéine, ne codant pas de protéines, etc.

P.S. L'ADN bactérien ne recombine pas à proprement parler avec le génome du phage... C'est mieux à faire gaffe au vocabulaire et à la clarté d'expression tout de même

mais non c'est la combinaison des ADNc issue des ARNm d'un tissu ou cellule humaine avec ADN d'un phage après avoir enlever quelques gènes inutile pour faire de la place pour l'ADNc et ceci avec une digestion par exemple avec ECOR1 ...c'est la procédure étudier ensuite on infecte des bactérie avec...
on a besoin de cribler un tel ADNc parmi plusieurs on peut le faire sans se soucier des autre gène du phage ou autre

[IngDr]

AVec les banques des séquences complètes des génomes, on peut aussi utiliser le BLAST pour trouver des gènes homologues, variants du même gènes ("splicés")....etc.
Tu le sais d'ailleurs certainement que c'est le cas pour construire les arbres phylogéniques et composer les familles multi-génes !

Merci de t'inquiéter pour mes connaissances. Il faut lire ce que j'écris. Quand j'utilise les mots "maintenant" et "il y a 10 ans", ce n'est pas pour rien. J'aurai aimé t'y voir il y a pas plus de 10 ans, à faire des blast pour trouver des gènes ou des familles de gènes sur... des banques d'ADNc ayant été séquencées.
Et comme l'a précisé MaliciaR, tous les organismes n'étant pas intégralement, correctement, ... séquencés, ton blast ne trouvera pas ce qui n'est pas encore présent dans sa banque de données, alors que cela peut être présent dans une banque... de cDNA.

Ensuite pour Tilouh, pour en revenir à ton cDNA sur gélose :
de 1. pourquoi sur gélose et pas directement sur filtre ? A moins que ton cDNA soit dans une bactérie, auquel cas, une infection par un phage est un tres bon moyen de transduction...
de 2. on n'en est pas encore à la détection de la molécule unique d'ADN, surtout pas hybridation (eventuellement par QPCR, et encore).
de 3. tu fais quoi une fois de tu as détecté ton cDNA ?

[invitea069fc56]

Merci de t'inquiéter pour mes connaissances. Il faut lire ce que j'écris. Quand j'utilise les mots "maintenant" et "il y a 10 ans", ce n'est pas pour rien. J'aurai aimé t'y voir il y a pas plus de 10 ans, à faire des blast pour trouver des gènes ou des familles de gènes sur... des banques d'ADNc ayant été séquencées.
Et comme l'a précisé MaliciaR, tous les organismes n'étant pas intégralement, correctement, ... séquencés, ton blast ne trouvera pas ce qui n'est pas encore présent dans sa banque de données, alors que cela peut être présent dans une banque... de cDNA.

Ce que je voulais lire dans mon post c'est que les banques des séquençages remplacent les banques ADNc des phages !
Oui les banques ADNc étaient indispensables il y a quelque années mais maintenant, avec toutes les bases de données disponibles et une simple PCR, je ne sais pas trop si construire des banques ADNc est vraiment utile, mais bon... !

[invitea069fc56]

Ce que je voulais dire dans mon post c'est que les banques des séquençages remplacent les banques ADNc des phages !
Oui les banques ADNc étaient indispensables il y a quelque années mais maintenant, avec toutes les bases de données disponibles et une simple PCR, je ne sais pas trop si construire des banques ADNc est vraiment utile, mais bon... !

J'ai éliminé la partie redondante de votre message.
Pour la modération,
piwi

[MaliciaR]

mais non c'est la combinaison des ADNc issue des ARNm d'un tissu ou cellule humaine avec ADN d'un phage après avoir enlever quelques gènes inutile pour faire de la place pour l'ADNc et ceci avec une digestion par exemple avec ECOR1 ...c'est la procédure étudier ensuite on infecte des bactérie avec...

Tu clones un gène humain dans un génome de phage, toi? Comment ça, on enlève des gènes d'un phage pour faire de la place...? Tu es en quelle année, en fait, parce que tes explications son un peu... novatrices

on a besoin de cribler un tel ADNc parmi plusieurs on peut le faire sans se soucier des autre gène du phage ou autre

Euh... tu sais ce que ça signifie exactement un crible de banque d'ADNc?

Ce que je voulais lire dans mon post c'est que les banques des séquençages remplacent les banques ADNc des phages !

C'est quoi, une banque de séquençage?

[gorben]

Salut,

Je sais pas si ca vient de moi (pas reveille) ou de l'auteur du sujet, mais perso je n'ai rien compris aux differentes interventions.
Je pense que vous devriez regarder sur le net ou sur un bouquin les definitions de Northern blot, banque cDNA etc...

Concretement une des utilisations d'une banque d'ADNc c'est de chercher un gene relie a un phenotype.

Par ex : il existe une maladie ou les cellules de la peau ne s'accrochent pas ensemble... pourquoi?
Tu transfectes une banque d'ADNc dans tes cellules "malades", et tu regardes apres transfection lesquelles collent a la boite. Tu les recuperes, extrait ton cDNA issus de la banque, sequences et trouves le gene qui par sa presence permet de restaurer un attachement normal de tes cellules. De la tu peux commencer a comprendre le pourquoi de la maladie.
Sans la banque ben... tu galeres...

A+

[invitefdfa7a92]

Ensuite pour Tilouh, pour en revenir à ton cDNA sur gélose :
de 1. pourquoi sur gélose et pas directement sur filtre ? A moins que ton cDNA soit dans une bactérie, auquel cas, une infection par un phage est un tres bon moyen de transduction...
de 2. on n'en est pas encore à la détection de la molécule unique d'ADN, surtout pas hybridation (eventuellement par QPCR, et encore).
de 3. tu fais quoi une fois de tu as détecté ton cDNA ?

ou bien directement sur filtre; oui oui
pour la 3: on veut savoir si une telle protéine donc ARNm donc ADNc se trouve dans Xtissu dans Xcondition (on démarre par collection de tous les ARNm de la cellule soit des milliers pour faire le criblage d'une recherchée..)
pour la 2: sinon je vois pas pourquoi on utilise cette méthode, justement un exemple m'aiderai peut être, j'essaie de comprendre !
merci

[invitefdfa7a92]

Tu clones un gène humain dans un génome de phage, toi?
Euh... tu sais ce que ça signifie exactement un crible de banque d'ADNc?

ou d'une souris peu importe)
peux tu me dire ce que ça signifie peut être que quelque chose me manque?
merci

[MaliciaR]

peux tu me dire ce que ça signifie peut être que quelque chose me manque?
merci

Je te conseillerais, comme Gorben, de vraiment bien te documenter en biologie moléculaire et génétique. Je ne sais pas si tu es en fac de bio, mais tu fais des erreurs épouvantables et c'est très difficile de te faire un cours ici.

Bonne continuation

[invitefdfa7a92]

Je te conseillerais, comme Gorben, de vraiment bien te documenter en biologie moléculaire et génétique. Je ne sais pas si tu es en fac de bio, mais tu fais des erreurs épouvantables et c'est très difficile de te faire un cours ici.

Bonne continuation

ben tu m'aides vachement j'ai pas besoin de bouquins!!

[piwi]

C'est une des merveilles de ce forum. Pour ce qui est de la bio mol on peut trouver pratiquement toutes les réponses grâce aux uns et aux autres.
Cependant, même si je suis impressionné par l'étendu des notions que vous déployez, je pense qu'il y a encore du chemin pour les maitriser. Au boulot moussaillon! Futura-sciences sera là pour vous y aider.

Cordialement,
piwi

[invitefdfa7a92]

tu sais ce que ça signifie exactement un crible de banque d'ADNc?

peux tu me dire ce que ça signifie peut être que quelque chose me manque?

c'est très difficile de te faire un cours ici.

peut être pas un cours mais à ce qui ressemble à une description!

[MaliciaR]

Bonjour, Tilouh,

Je dois t'avouer que ta manière de traiter les intervenants ici est peu ... hum, encline à nous enthousiasmer de te répondre.
Nous ne sommes pas obligés de te répondre : si on le fait, c'est dans le but de t'aider dans les limites du raisonnable. Justement, c'est de ces dernières qu'il s'agit : ta question est une question de cours. Tu viens demander qu'on t'explique l'intérêt d'une technique, mais tu montres des lacunes trop importantes dans les connaissances de base pour qu'on puisse facilement y palier. C'est pour cette raison qu'on t'a dit que tu devrais te documenter plus en profondeur, le forum n'étant pas l'endroit idéal pour dispenser des cours magistraux.
Donc, au lieu de nous traiter avec exaspération et manque de respect, pourrais-tu faire l'effort de te pencher sur tes bases? Tu verras que pas mal de choses s'éclairciront. Si toutefois tu as des questions claires et précises, nous serons ravis de pouvoir y apporter des réponses.

Bonne continuation

[invitefdfa7a92]

Bonjour, Tilouh,

Je dois t'avouer que ta manière de traiter les intervenants ici est peu ... hum, encline à nous enthousiasmer de te répondre.
Nous ne sommes pas obligés de te répondre : si on le fait, c'est dans le but de t'aider dans les limites du raisonnable. Justement, c'est de ces dernières qu'il s'agit : ta question est une question de cours. Tu viens demander qu'on t'explique l'intérêt d'une technique, mais tu montres des lacunes trop importantes dans les connaissances de base pour qu'on puisse facilement y palier. C'est pour cette raison qu'on t'a dit que tu devrais te documenter plus en profondeur, le forum n'étant pas l'endroit idéal pour dispenser des cours magistraux.
Donc, au lieu de nous traiter avec exaspération et manque de respect, pourrais-tu faire l'effort de te pencher sur tes bases? Tu verras que pas mal de choses s'éclairciront. Si toutefois tu as des questions claires et précises, nous serons ravis de pouvoir y apporter des réponses.

Bonne continuation

c'est claire que personne n'est obliger de répondre ni d'être utile ni de participer, cependant ce forum est conçu pour partager le savoir et de vouloir essayer d'aider ceux qui ont besoin de cette aide, en plus des livres ou des cours. et comme je t'ai déjà dit que la partie qui t'as déranger était du cours pas de mon imagination que cette dernière est préciser par "je pense".
merci je souhaite surtout ma continuation ici plus que dans d'autre choses! je pense que c'est largement hors sujet mais c'est parce que le tien l'était.

[invitefdfa7a92]

je crois avoir compris l'utilité de cette méthode:
- on veut chercher la séquence d'un gène codant pour une protéine présente dans Xcellule dans Xcondition(donc on vérifie de ce fait si elle est présente dans cette condition et savoir la séquence du gène codant). et puisque le séquençage de protéines est trop difficile et peu fiable que le séquençage d'un ADNc on essaie de:
- avoir tout les ARNm de cette cellule ou tissu soit des milliers
- puis produire leurs ADNc donc c'est une banque d'ADNc
- essayer de cribler un ADNc d'intérêt avec le minimum d'information à partir de la protéine d'intérêt suivant tout la procédure du criblage d'une banque d'ADNc
pour séquencer l'élu(donc on a besoin des phage pour l'amplification indispensable pour le séquençage enzymatique).
je pense que ça peut être un intérêt parmi d'autres de cette méthode jusqu'à preuve du contraire!?

[invitefdfa7a92]

je crois avoir compris l'utilité de cette méthode:
- on veut chercher la séquence d'un gène codant pour une protéine présente dans Xcellule dans Xcondition(donc on vérifie de ce fait si elle est présente dans cette condition et savoir la séquence du gène codant). et puisque le séquençage de protéines est trop difficile et peu fiable que le séquençage d'un ADNc on essaie de:
- avoir tout les ARNm de cette cellule ou tissu soit des milliers
- puis produire leurs ADNc donc c'est une banque d'ADNc
- essayer de cribler un ADNc d'intérêt avec le minimum d'information à partir de la protéine d'intérêt suivant tout la procédure du criblage d'une banque d'ADNc
pour séquencer l'élu(donc on a besoin des phage pour l'amplification indispensable pour le séquençage enzymatique).
je pense que ça peut être un intérêt parmi d'autres de cette méthode jusqu'à preuve du contraire!?

ps: le minimum d'information à partir de la protéine c'est de faire une fragmentation en peptides puis avoir la séquence de ces derniers et créer des oligonucléotides(qui nous aide pour le criblage) ou bien simplement par injection de cette protéine dans un lapin et avoir des anti-corps(pour le criblage). donc le problème du départ c'était l'ignorance de la difficulté pour savoir la séquence d'une protéine(ses acides aminés), ce qui ma emmener à faire des fausses hypothèses..