Nettoyage d'ARNs & Transfert de protéines

[invite10adf645]

Bonjour à tous,
j'aurai besoin de vos avis sur deux questions :

1) J'ai des ARNs que je voudrait "nettoyer". La DO 260/280 est bonne (>2) mais je suis apparemment contaminé par les sels du tampon RLT (extraction sur colonne) puisque ma DO 260/230 n'est que de 1,3. Est-ce que vous pensez que ça peut poser un problème pour les envoyer en Q-RT-PCR ? Et si oui, pour éliminer ces sels, est-ce qu'une simple précipitation à l'isopropanol (+lavages à l'EtOH) suffirait ?

2) Je souhaite transférer une protéine de 210 kDa sur membrane PVDF. J'ai fait un transfert à 70V sur 90 min mais les hauts poids moléculaires n'ont pas bien transféré (il restait un peu d'échelle dans mon gel). Quelqu'un a une idée des meilleurs conditions de tranfert pour ce type de protéines ? J'ai entendu parler de transfert overnight à 4°C 12V...

Voilà merci à vous !
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[emma59]

Salut!

Concernant les ARN, tu peux laisser les tampons de lavage "infiltrer" la colonne pendant 5-10 min avant de centrifuger (le RPE en particulier).
Si tes échantillons sont congelés dans le RLT ou le Trizol, tu peux aussi dissoudre les sels avant extraction en chauffant tes échantillons 30 min à 40°C.

Pour le transfert de ta protéine, fait le 2H à 100 V (en utilisant un bain de glace bien sûr). Sinon garde le même voltage mais laisse plus longtemps. Je n'utilise pas le PVFD alors moi je transfert avec de l'éthanol qui me donne de meilleurs résultats mais toi tu es obligée de prendre le méthanol.

bon courage

[invite10adf645]

Ok j'essaierai tes conditions de transfert, merci.

Pour l'extraction d'ARN, la contamination vient bien du fait que j'ai utilisé du tissu congelé (jeté dans le tampon RLT à 20°C). Le commercial m'a conseillé de chauffer les échantillons juste 5 min à 30°C après broyage puis de bien vortexer pour dissoudre les sels.
Mais ma première question concernait les échantillons que j'ai déjà extraits en fait. Ils sont un peu précieux et je voudrait les nettoyer plutôt que de refaire la manip.

[emma59]

Il existe des colonnes pour purifier l'ARN je pense comme l'ADN.
Sinon tu peux les repasser sur ta colonne d'extraction, par contre, tu risques de perdre au niveau rendement d'ARN alors tout dépend de ta concentration. Si tu précipites à l'isopropanol, tu risques également de perdre de l'ARN mais si il t'en reste suffisamment pour réaliser une RT PCR ça devrait aller.
Tu pourrais peut ëtre comparer les 2 méthodes avec des échantillons moins précieux.
Autre info, tu peux augmenter la récupération de l'ARN en utilisant du glycogène concernant la méthode à l'isopropanol par contre le glycogène est incompatible avec la technique sur colonne , pour cela tu dois utiliser un "carrier" spécial.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite10adf645]

Tu as raison, je vais comparer les deux sur mes échantillons témoins (moins difficiles à refaire).

[piwi]

Je ne voudrais pas casser la fête mais en général pour les ARN on considère que les extraits sont propres quand 1.7<DO<2 (1,7 étant la limite basse d'acceptabilité et 2 étant le Saint Graal. Une bonne extraction donne des DO de l'ordre de 1.8). Quand vous annoncez une DO>2 il faut quand même vous demander si il n'y a pas un souci de contamination quelque part (de l'ADN génomique?).

Cordialement,
piwi

[invite10adf645]

Mes échantillons sont traités à la DNase donc à priori pas de problème à ce niveau là (je les ai en plus fait migrer pour vérifier).
Quand je dis >2 c'est qu'ils sont tous entre 2 et 2,1.
Je ne pense pas que ce soit un problème. Si ?

[piwi]

La théorie vous dirait que c'est parfait. Seulement en général on peut avoir un échantillon comme cela, mais toute une série ça semble trop beau pour être vrai.

[invite10adf645]

Rhooo, j'arrive avec un problème de DO à 230, mais tout fier de ma DO à 280, et là vous allez me faire douter...
Tous mes échantillons (en même temps il n'y en a que 4) ont une DO280 équivalente, mais ce n'est peut-être pas qu'un coup de bol. J'ai mis au point un protocole de prélèvement hyper standardisé, et l'extraction se fait sur colonnes RNeasy (à priori pas trop de variabilité possible là non plus). Donc ce qui marche pour un devrait marcher pour tous !
Une preuve est que mes échantillons ont TOUS le même problème de DO 260/230 (ils sont systématiquement entre 1,25 et 1,35).

[emma59]

Bonjour

Je me permets. J'ai un protocole d'extraction d'ARN tissulaires
en colonne "Rneasy" optimisé et j'obtiens pour tous mes échantillons les mêmes DO 260/280 et 260/230 environ de 2.(Si ça peut rassurer fanou)

Par contre, j'ai des soucis sur un protocole d'extraction d'ARN issus de plasma où là j'ai des problèmes de contamination en sels et des DO vers 230 problématiques.

[invite10adf645]

oui bien sûr je suis preneur !
merci emma

de mon côté j'utilise un des protocoles fourni par Qiagen, pour lequel j'ai simplement adapté les volumes de tampon pour optimiser le rendement, et ajouté une étape pour récupérer les protéines après la première centrifugation.

[emma59]

Tu utilises un kit permettant d'extraire les protéines et les acides nucléiques ou juste un kit permettant d'extraire l'ARN et au lieu d'éliminer léluat tu le récupères et tu récupère les protéines? Dans le second cas, le tampon RLT convient aux protéines (il est sensé inactiver les RNases)?

[invite10adf645]

J'utilise le kit RNeasy Mini. Il est prévu pour extraire les ARNs à la base mais on peut aussi récupérer les protéines dans le tampon RTL. Il suffit juste de faire une précipitation à l'acétone.
Concernant les protéine j'ai eu un gros culot donc ça a l'air de marcher mais j'ai pas encore pu faire de quantification parce que mon kit de dosage n'est pas adapté (il interfère avec mon tampon de reprise). J'attends un kit de dosage approprié d'ici peu puis je les ferai migrer pour voir la tête qu'elles ont.
La technique est donnée dans le manuel du kit, mais j'utilise celle publiée par JM Tolosa en 2007 (Biotechniques n°43).

[emma59]

Merci pour les infos. Moi j'analyse les arn et les protéines mais pour cela je réalise un prélèvement pour chaque. Je sais qu'il existe un kit pour extraire l'ADN et les protéines de chez Qiagen (bien qu'on m'ait dit que les axtractions étaient moins bonnes que si elles étaient séparées) mais concernant l'ARN je ne sais pas. Je me demandais si le RLT altérait les protéines ou juste inactivait.
Tu crois qu'après précipitation dans l'acétone , tu arrives facilement à dissoudre tes protéines?

[invite10adf645]

Concernant la qualité des ARNs, ça ne change rien que tu récupère ou pas les protéines. Les protéines, quand à elles, sont censées être correctement extraites (d'après la biblio), mais j'attends de faire une migration pour m'en assurer.
Concernant la précipitation tu as raison, c'est hyper dur à redissoudre. Je le fais dans du tampon 2D (saturé en urée, thiourée + CHAPS et SDS) et j'incube mes échantillons 1 nuit à 4°C (pas de congélation). Ca facilite la dissolution (le culot devient translucide, un peu gélatineux).

Je faisait aussi un prélèvement pour les ARNs et un autre pour les protéines avant, mais en extrayant les deux du même échantillon je fais une grosse économie de temps (traitement chronique) et je pense aussi que le résultat est plus informatif.

[emma59]

Hello!

Je me doute que la qualité de l'ARN ne change pas que tu récupère ou non les protéines avec le Rneasy kit Qiagen puisque'à la base c'est un kit optimiser pour extraire l'ARN. Je parlais d'autres kits. Moi je n'extrait pas mon ARN le jour du prélèvement , je le congèle après l'avoir mis dans du RNA later c'est pour cela que je ne peux pas récupérer les protéines par la suite. Ce n'est pas compatible.
On verra si tes protéines ont une "bonne tête".

[emma59]

Recoucou!
Fanou, je me demande vraiment si tu fais une économie de temps en extrayant les protéines en même temps. Je pense par contre que c'est interessant pour comparer la réponse expression génique et synthèse des protéines correspondante surtout si tu travaille sur des échantillons de petite taille, ou très hétérogène.

[invite10adf645]

Moi aussi je congèle, mais les tissus secs. Je prélève en maintenant le tissu dans du PBS à 4°C puis je jette immédiatement mes échantillons (en cryotubes) dans l'azote liquide. Ensuite je les garde à -80°C. Ca évite d'utiliser du RNA later.

[invite10adf645]

EDIT : j'avais pas vu le deuxième message.
Je ne pense pas gagner beaucoup de temps sur l'extraction en elle-même mais j'y gagne énormément sur le prélèvement. Je ne peux prélever que 8 à 10 mg de tissu par animal, et je dois pooler les tissus de plusieurs animaux ensemble. Comme en plus je bosse sur un modèle d'inflammation chronique c'est assez fastidieux... Il me faut au moins une semaine pour avoir mes échantillons au complet !

[emma59]

Le RNA later permet d'éviter la dégradation des arn lors de la décongélation. C'est utile si tu dois couper un certain poids pour l'extraction ou disséquer certaines parties et que ça prend un peu de temps sinon il faut couper sur de la carbo. J'ai fait des tests sur la qualité de l'ARN.Moi je ne peux pas me permettre de ne pas utiliser du RNA later , en plus ça permet de garder plus longtemps les échantillons à -80°C pour une étude ultérieure.Par contre, c'est cher mais j'ai eu de moins bon résultats avec du RNA later fait maison alors...

[invite10adf645]

Oui j'y avais pensé il y a quelque temps (d'autant qu'on en a au labo).
Mais comme tu dis, c'est mort pour les protéines après je crois bien.
Cela dit j'ai le coup de main et je ne met que 5 min entre l'euthanasie et le moment où je snap freeze mes échantillons, et le tissu est disséqué à 4°C.
Pour le moment je n'ai pas eu de problèmes de dégradation.

[emma59]

Je comprends , je travaillais comme ça aussi dans mon ancien labo.
Mais là, même en disséquant avant congélation je perd en qualité même si je suis rapide. Mais ce n'est pas grave même avec un ARN de qualité correcte et non pas axcellente, on arrive à faire une PCR.
Quand mon tissus est imbibé de RNA later je dissèque en toute sécurité (je suis obligée sinon du collagène bouche ma colonne ).