Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 3 sur 3

Interprétation d'un Southern Blot

  1. #1
    Anetheron

    Interprétation d'un Southern Blot

    Re-bonjour!

    J'ai une petite question à propos de l'interprétation d'un Southern Blot.

    Voici un résumé de l'énoncé:

    Un Southern est réalisé sur de l'ADNg de trois rats mâles digéré par ECO R1. Le rat 1 est sain alors que les deux autres ont une maladie génétique associée à un gène G situé sur le chromosome X. On hybride la membrane avec une sonde d'ADNc de 500pb correspondant au gène en question.
    On obtient l'autoradiogramme ci-dessous. L'intensité des bandes est homogène sur tout l'autoradiogramme.
    (les B signifient qu'on a une bande)

    PM.....Rat 1.....Rat 2.....Rat 3

    25kb


    4kb.......B..........B........ ....B
    3kb.......B..........B........ ....B


    1kb.......B................... .....B




    0.01kb
    La première question demande d'expliquer la présence et la taille des bandes. J'ai répondu que la présence des bandes était dûe à l'hybridation de la sonde lorsqu'elle rencontrait la séquence du gène dont elle est complémentaire, et donc que le gène était présent chez les trois rats. On a trois bandes chez le rat sain, le gène sauvage contient donc dans sa séquence 2 sites de restriction EcoR1.
    Et enfin pour la taille, j'ai expliqué ça par le fait qu'on travaille sur de l'ADN génomique eucaryote, et donc que le gène comprenait des introns qui expliquaient qu'on ait des bandes si lourdes.

    Je ne pense pas être à côté de la plaque, mais j'aimerais confirmation par quelqu'un qui vaut mieux que moi en la matière vu que globalement je rame un peu, s'il vous plaît.

    C'est surtout la deuxième question qui me pose problème: "formulez des hypothèses sur les mutations qui touchent les rats 2 et 3".

    Déjà le rat 2. On note qu'une bande disparaît (celle de 1kb) alors que les deux autres sont identiques à celles du rat témoin.
    J'avais d'abord pensé à une mutation ponctuelle sur le site de restriction Eco R1, mais l'homogénéité des bandes infirme cette hypothèse. Si c'était le cas, on devrait avoir une des deux bandes plus épaisses, voire la disparition de la bande de 3kb au profit de la 4kb.
    J'ai ensuite pensé à un crossing-over, ce qui expliquerait qu'une partie du gène soit partie alors que les deux autres morceaux sont toujours là mais... en y repensant après, lors d'un crossing-over le morceau qui aurait changé de chromosome serait toujours dans le génome mais à une autre place, donc vu qu'on a l'adn complet, un crossing over ne se serait pas vu au Southern (juste?).

    Je pense que, vu que la sonde fait 500pb, une simple mutation ponctuelle ne serait pas gênante, car il resterait 499 appariements, donc la sonde s'hybriderait toujours.

    Donc en gros, je ne comprends absolument pas ce que peux bien avoir le rat n°2.
    J'ai fait une recherche sur Internet qui n'a pas donné grand chose. j'ai tout de même trouvé des allusions à des mutations dites "dynamiques", qui seraient la répétition d'un certain triplet un certain nombre de fois, et qui causerait la maladie à partir d'un certain nombre de répétition. Le problème c'est qu'ici on a une disparition d'une partie de la séquence (et non un ajout), or je n'ai vu sur aucun site que les triplets répétés pouvaient aussi s'effacer d'une génération à l'autre, donc encore une fois, impasse.

    La dernière possibilité que je voie serait qu'un bout du chromosome, dont une partie du gène), aurait disparu (sans être échangé avec un autre chromosome), mais je ne sais pas s'il est possible qu'un bout de gène s'évanouisse dans la nature sans être incorporé à un autre chromosome.

    Aurais-je fait un mauvais raisonnement quelque part? Ou y a-t-il un élément que je n'aurais pas pris en compte et qui explique tout?

    Et enfin, pour le rat 3, l'explication me semble plus simple: une mutation ponctuelle, ou l'addition ou suppression d'un seul nucléotide ne génèrerait pas suffisemment de mésappariement pour que la sonde ne s'hybride pas, et donc le nombre et la taille des bandes ne varie pas. Juste?

    Merci d'avance à ceux qui pourront m'aider.

    -----


  2. #2
    piwi

    Re : Interprétation d'un Southern Blot

    J'avais d'abord pensé à une mutation ponctuelle sur le site de restriction Eco R1, mais l'homogénéité des bandes infirme cette hypothèse.
    Vous avez raison de rejeter cette hypothèse. Mais votre justification n'est pas bonne.
    ----------3kb-----------------Xkb
    -----------------------E1---------------

    Si on fait sauter le site E1 on devrait avoir un fragment 3+Xkb. Or ce n'est pas ce que l'on observe.


    --------------------------------
    E1-----------------------E1---------------E1
    -----------3kb-----------------1kb
    Si le site E1 n'est pas là on a un fragment de 4kb () Si il est là, on a un fragment de 3 et 1kb ( re ).
    Maintenant il faut se demander ce que signifie que l'on ne voit que la bande de 3kb en 2. La conclusion la plus évidente est qu'elle ne peut pas se fixer sur la bande 1kb. Il y a donc une mutation en aval du site E1. Et vous avez raison, ce n'est probablement pas une mutation ponctuelle. La sonde la bypasserait facilement.

    --------------------------------
    E1-----------------------E1---------------E1----------------------
    E1-----------------------E1-----------E1
    --------------------------
    ---------------------------\
    ---------------------------\------

    Wouala pour quelques pistes.
    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  3. #3
    Anetheron

    Re : Interprétation d'un Southern Blot

    Je pensais en fait qu'une mutation non provoquée ne touchait toujours qu'un seul nucléotide à la fois (partant du principe que chaque nucléotide était une entité ayant X risques de subir une mutation, la probabilité pour que plusieurs côte à côte subissent une mutation était quasiment nulle), mais en fait c'est là que je me trompe. Après recherche complémentaire, il semblerait en effet que des morceaux entiers de séquence répétée puissent disparaître (http://formation.etud.u-psud.fr/biol.../23add_del.htm).

    Une addition ne serait pas gênante vu que la séquence complémentaire ne serait pas modifiée, la sonde s'hybride toujours. C'est donc une délétion d'une répétition dans la séquence du gène sauvage.

    La délétion doit être énorme pour qu'une sonde de 500pb ne puisse plus s'hybrider.

    Merci.

Discussions similaires

  1. [Biochimie] PCR & Southern Blot
    Par babaz dans le forum Biologie
    Réponses: 11
    Dernier message: 01/02/2008, 21h39
  2. [Biologie Moléculaire] Réalisation d'un Southern Blot
    Par montreux_d dans le forum Biologie
    Réponses: 8
    Dernier message: 11/12/2007, 19h57
  3. [Biologie Moléculaire] analyse southern et northern blot
    Par véto2012 dans le forum Biologie
    Réponses: 11
    Dernier message: 06/11/2007, 22h48
  4. [biologie moléculaire] Southern blot
    Par wishangel dans le forum Biologie
    Réponses: 18
    Dernier message: 19/07/2007, 13h59
  5. Southern blot
    Par XIII dans le forum Biologie
    Réponses: 6
    Dernier message: 12/04/2006, 14h35