Principe de la PCR

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ANIMMATION : http://www.biomultimedia.net/archiv/pcr/pcr.htm

introduction :
La Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
La PCR (Polymerase Chain Reaction) fut inventée par K. Mullis en 1983 et brevetée en 1985. Son principe repose sur l’utilisation de l’ADN
polymérase, il s’agit d’une réplication in vitro de séquences spécifiques d’ADN. Cette méthode permet de générer à des dizaines de milliards
d’exemplaires un fragment d’ADN particulier (la séquence d’intérêt, ADN d’intérêt ou ADN cible) à partir d’un extrait d’ADN (ADN matriciel). En
effet, si la séquence d’intérêt est présente dans l’extrait d’ADN, il est possible de sélectivement la répliquer (on parle d’amplification) en très grande
quantité. La puissance de la PCR repose sur le fait que la quantité d’ADN matriciel n’est pas, en théorie, un facteur limitant. On peut donc amplifier
des séquences nucléotidiques à partir de quantités infinitésimales d’extrait d’ADN.
La PCR est donc une technique de purification ou de clonage. L’ADN extrait à partir d’un organisme ou d’un échantillon contenant des ADN d’origines
diverses n’est pas directement analysable. Il contient une masse trop importante de séquences nucléotidiques. Il convient donc d’isoler, de purifier
la ou les séquences qui présentent un intérêt, qu’il s’agisse de la séquence d’un gène ou de séquences non codantes (introns, transposons, mini
ou microsatellites…). À partir d’une telle masse de séquences que constitue l’ADN matriciel, la PCR peut donc sélectionner une ou plusieurs
séquences déterminées et les amplifier par réplication à des dizaines de milliards de copies. La réaction terminée, la quantité extrêmement faible
d’ADN matriciel contenue dans l’échantillon PCR n’aura pas varié. En revanche, la quantité de la ou des séquences amplifiées (l’ADN d’intérêt)
sera très grande. La PCR permet donc d’amplifier un signal à partir d’un bruit de fond, il s’agit donc bien d’une méthode de clonage moléculaire,
et cloner revient à purifier.
Les applications de la PCR sont multiples. C’est une technique désormais incontournable en biologie cellulaire et moléculaire. Elle permet
notamment en quelques heures le « clonage acellulaire » d’un fragment d’ADN grâce à un système automatisé, alors qu’il faut plusieurs jours avec
les techniques standard de clonage moléculaire. D’autre part, la PCR est largement utilisée à des fins de diagnostic pour détecter la présence d’une
séquence d’ADN spécifique de tel ou tel organisme dans un fluide biologique. Elle est aussi employée pour réaliser des empreintes génétiques,
qu’il s’agisse de l’identification génétique d’une personne dans le cadre d’une enquête judiciaire, ou de l’identification de variétés animales,
végétales ou microbiennes destinée à des tests de qualité alimentaire, de diagnostic ou de sélection variétale. La PCR est encore indispensable
à la réalisation d’un séquençage ou d’une mutagénèse dirigée. Enfin, il existe des variantes de la PCR : real-time PCR, PCR compétitive, PCR in
situ, RT-PCR…
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But et principe
La PCR permet donc d’obtenir par réplication in vitro de multiples copies d’un fragment d’ADN à partir d’un extrait. L’ADN matriciel peut tout autant
être de l’ADN génomique que de l’ADN complémentaire obtenu par RT-PCR à partir d’un extrait d’ARN messagers (ARN poly-A), ou encore de
l’ADN mitochondrial.
Le mélange réactionnel et les cycles de température
La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans un mélange réactionnel qui comprend l’extrait d’ADN (ADN matriciel), la Taq polymérase,
les amorces et les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) en excès dans une solution tampon. Les tubes contenant le mélange
réactionnel sont soumis à des cycles de température réitérés plusieurs dizaines de fois dans le bloc chauffant d’un thermocycleur (appareil qui
comporte une enceinte où l’on dépose les tubes échantillons et dans laquelle la température peut varier, très rapidement et précisément, de 0 à
100°C par effet Peltier). L’appareil permet la programmation de la durée et de la succession des cycles de paliers de température. Chaque cycle
comprend trois périodes de quelques dizaines de secondes.
La dénaturation : 94°C
La première période s’effectue à une température de 94°C, dite température de dénaturation. À cette température, l’ADN matriciel, qui sert de
matrice au cours de la réplication, est dénaturé : les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une température supérieure à 80°C et les
ADN double-brin se dénaturent en ADN simple-brin (ADN monocaténaires).
L’hybridation : 40 – 70°C
La deuxième période s’effectue à une température généralement comprise entre 40 et 70°C, dite température d’hybridation des amorces. La
diminution de la température permet aux liaisons hydrogène de se reformer et donc aux brins complémentaires de s’hybrider. Les amorces,
courtes séquences monocaténaires complémentaires de régions qui flanquent l’ADN à amplifier, s’hybrident plus facilement que les longs brins
d’ADN matriciel. Plus la température d’hybridation est élevée, plus l’hybridation est sélective, plus elle est spécifique.

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Les amorces (primers)
Pour parvenir à amplifier sélectivement des séquences nucléotidiques à partir d’un extrait d’ADN par PCR, il est indispensable de disposer d’au
moins une paire d’oligonucléotides. Ces oligonucléotides, qui vont servir d’amorces pour la réplication, sont synthétisés par voie chimique et doivent
montrer la meilleure complémentarité possible avec les deux extrémités de la séquence d’intérêt que l’on souhaite amplifier. L’une des amorces
est conçue pour reconnaître par complémentarité une
séquence située en amont du brin 5’-3’ du fragment
d’ADN d’intérêt ; l’autre pour reconnaître, toujours
par complémentarité, une séquence située en amont
du brin complémentaire (3’-5’) du même fragment
d’ADN. Les amorces sont des ADN monocaténaires
dont l’hybridation sur les séquences flanquant la
séquence d’intérêt permettra sa réplication de façon
sélective. La taille des amorces est généralement
comprise entre 10 et 30 nucléotides afin de garantir
une hybridation suffisamment spécifique sur les
séquences d’intérêt de l’ADN matriciel.
D’autres critères, importants mais secondaires par
rapport aux précédents, doivent être pris en compte
pour la conception et l’emploi des amorces. La
séquence des amorces doit comporter la plus grande
proportion possible de guanines et de cytosines.
En effet, la liaison entre guanines et cytosines est
assurée par trois liaisons hydrogène au lieu de deux
entre les adénines et les thymines, ce qui se traduit
par une meilleure stabilité de la liaison au moment de l’hybridation des amorces. Plus les amorces sont riches en cytosines et guanines, plus leur
température d’hybridation (Tm) peut être élevée (elle est en général comprise entre 40 et 65°C, mais peut atteindre 70°C) et donc plus la spécificité
Au cycle suivant, les fragments synthétisés au cycle précédent servent à leur tour de matrice et au bout de quelques cycles, l’espèce prédominante
correspond à la séquence d’ADN comprise entre les régions où les amorces s’hybrident. Il faut compter 20 à 40 cycles pour synthétiser une
quantité analysable d’ADN (environ 0,1 microgramme). Chaque cycle voit théoriquement doubler la quantité d’ADN présente au cours du cycle
précédent.
Il est recommandé de rajouter un cycle final d’élongation à 72°C, notamment lorsque la séquence d’intérêt est de grande taille (supérieure à 1
kilobase), à raison de 2 minutes par kilobase.
La PCR permet d’amplifier des séquences dont la
taille est inférieure à 6 kilobases.
La Taq polymérase
L’ADN polymérase permet la réplication. On utilise
une ADN polymérase purifiée ou clonée à partir
d’une bactérie extrêmophile, Thermus aquaticus,
qui vit dans les sources chaudes et résiste à des
températures supérieures à 100°C. Cette polymérase
(Taq polymérase) possède la caractéristique
remarquable de résister à des températures de
l’ordre de 100°C, lesquelles sont généralement
suffisantes pour dénaturer la plupart des protéines.
Thermus aquaticus trouve sa température de confort
à 72°C, température optimum pour l’activité de sa
polymérase.
Les conditions réactionnelles
Les volumes de milieu réactionnel varient entre 10 et
100 μl. Il existe une multitude de formules de milieux

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réactionnels. Il est toutefois possible de définir une formule standard qui convient à la plupart des réactions de polymérisation en chaîne. Cette
formule, à peu de chose près, a été choisie par la plupart des fabricants et fournisseurs qui, du reste, délivre une solution tampon prête à l’emploi
avec la Taq polymérase. Concentrée 10 fois, sa formule est à peu près la suivante : 100 mM Tris-HCl, pH 9,0 ; 15 mM MgCl2, 500 mM KCl.
Il est possible de rajouter des détergents (Tween 20, Triton
X-100…) ou du glycérol afin d’augmenter les conditions de
stringence qui rendent plus difficile et donc plus sélective
l’hybridation des amorces. Cette démarche est généralement
employée pour réduire le niveau d’amplifications non spécifiques
dues à l’hybridation des amorces sur des séquences sans
rapport avec la séquence d’intérêt. On peut aussi réduire la
concentration en KCl jusqu’à l’éliminer ou encore augmenter la
concentration en MgCl2. En effet, certains couples d’amorces
fonctionnent mieux avec des solutions enrichies en magnésium.
D’autre part, lorsque sont utilisées de fortes concentrations en
dNTP, il convient d’augmenter la concentration en magnésium
à cause des interactions stoechiométriques entre magnésium
et dNTP qui réduisent la quantité de magnésium libre dans le
milieu réactionnel.
Les dNTP (desoxyribonucléotides) fournissent à la fois l’énergie
et les nucléotides nécessaires à la synthèse de l’ADN lors de la
polymérisation en chaîne. Ils sont incorporés au milieu réactionnel en excès, soit environ 200 μM final.
Selon le volume réactionnel choisi, la concentration en amorce peut varier entre 10 et 50 pmol par échantillon.
L’ADN matriciel peut provenir de n’importe quel organisme et même de matériels biologiques complexes qui comprennent des ADN de différents
organismes. Mais pour garantir la réussite d’une PCR encore faut-il que l’ADN matriciel ne soit pas trop dégradé. Ce critère est évidemment d’autant
plus crucial que la taille de la séquence d’intérêt est grande. Il est aussi important que l’extrait d’ADN ne soit pas contaminé par des inhibiteurs de
la réaction de polymérisation en chaîne (détergents, EDTA, phénol, protéines…). La quantité d’ADN matriciel dans le milieu réactionnel pour initier
la réaction d’amplification peut se réduire à une copie unique. La quantité maximale ne peut en aucun cas excéder 2 μg. En général, les quantités utilisées se situent dans une gamme comprise entre 10 et 500 ng d’ADN matriciel.
La quantité de Taq polymérase par échantillon est généralement comprise entre 1 et 3 unités.
Le choix de la durée des cycles de température et du nombre de cycles dépend de la taille de la séquence d’intérêt ainsi que de la taille et de la complémentarité des amorces. Il convient de réduire les durées au minimum non seulement pour un gain de temps mais aussi pour prévenir le risque d’amplification non spécifique. Pour la dénaturation et l’hybridation des amorces, 30 secondes suffisent généralement. Pour l’élongation, il faut compter 1 minute par kilobase d’ADN d’intérêt et 2 minutes par kilobase pour le cycle final d’élongation. Le nombre de cycles, généralement
compris entre 20 et 40, est inversement proportionnel à l’abondance en ADN matriciel.
Détection et analyse des produits PCR
Le produit d’une PCR est constitué d’un ou de plusieurs fragments d’ADN (la ou les séquences d’intérêt). La détection et l’analyse des produits
peuvent être très rapidement réalisées par électrophorèse sur gel d’agarose (ou d’acrylamide). L’ADN est révélé par une coloration au bromure
d’éthidium. Ainsi, les produits sont-ils visibles instantanément par transillumination aux ultraviolets (280 – 320 nm).
Des produits de très petite taille sont souvent visibles très près du front de migration sous forme de bandes plus ou moins diffuses. Ils correspondent
à des dimères d’amorces et parfois aux amorces elles-mêmes. Selon les conditions réactionnelles, il arrive que des fragments non spécifiques
d’ADN soient amplifiés en quantité plus ou moins abondante, formant des bandes nettes ou des « traînées » (smear).
Sur des systèmes automatisés, on utilise aujourd’hui un analyseur de fragment. Cet appareillage utilise le principe de l’électrophorèse capillaire.
La détection des fragments est réalisée par une diode laser. Cela n’est possible que si la PCR est réalisée avec des amorces couplées à des
fluorochromes.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Bonsoir.
Merci de votre intervention mais dans quel but l'avez vous fait? Le texte est il de vous? Si oui, merci
Sinon, merci d'en indiquer la source et si vous avez le droit de le reprendre ici.

Cordialement,
piwi

Note: pour tous ceux qui posent des questions sur la PCR, je suis en train de terminer un cours sur la qPCR. On verra sous quelle forme nous pourrons le mettre en ligne ici.

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j'esère que ses éllustration vont vous servir
http://www.biomultimedia.net/

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merci piwi. ça c'est juste un résumé de mon éxposé, j'ai remarqué que les questions sur pcr sont nembreuses donc je voulai participer par ce résumé .j'espère qu'il vous servira .. bonne nuit

[piwi]

Parfait alors. Encore une fois merci à vous!
J'espère que votre travail permettra à ceux qui vous lisent de trouver une réponse à leurs questions.

Cordialement,
piwi