Plusieurs questions sur les chromatographies échangeuses d'ions et d'affinité

[invite28fd8248]

Bonsoir à tous et à toutes!

Je rencontre une difficulté quant à l'action de la phase mobile (tampon d'élution) lors d'une chromatographie.

En cours,nous avons vu que suite à une chromatographie échangeuse d'ions(par exemple échangeuse d'anions),afin de séparer les protéines chargées négativement qui se sont liées aux résines chargées positivement,nous pouvions soit,faire varier le pH de la solution d'élution jusque obtenir le point isoéléctrique des protéines et ainsi les séparer des billes,ou bien utiliser un gradient de force ionique qui trierait en fonction de la charge...
**Première question : qu'est ce qu'un gradient de force ionique?

Nous avons parlé également de l'ajout d'ions dans la solution d'élution.Ces ions étant chargés de la même manière que la protéine d'intérêt( dans mon exemple nous aurions des ions negatifs ) et étant plus competitifs,ils permettraient à la protéine de se détacher des billes et se fixeraient à leur place...cependant,je ne comprends pas pourquoi utiliserions-nous du NaCl comme cela est expliqué dans la correction d'un exercice : le prof de TD nous a expliqué que pour détacher les protéines chargées fixées aux billes,nous pouvions utiliser du NaCl or,le NaCl est neutre! comment peut-il être compétitif?

**Pourriez vous m'éclairer sur ce point?

J'aimerais également savoir :

Dans la chromatographie par filtration sur gel,j'ai vu que l'on ne changeait pas la nature de la solution d'élution

**Quelle est la nature généralement utilisée de la solution d'élution pour une chromatograhie par filtration sur gel?

Dans la chromatographie par affinité,j'ai également vu en cours certaine notions,un peu floues...

**Quel est le rôle de l'excès de substrat(engendrer une compétition entre le substrat collé aux résines et celui ajouté,ce qui permettrait aux protéines de sortir de la colonne?) et celui de l'augmentation de concentration de NaCl dans ce genre de chromatographie ?

J'ai une toute dernière requête

Lors d'un QCM nous avions étudié des graphes de plusieurs chromatographies dont je vous ai joint une représentation approximative réalisée avec paint ...

Lors d'une question : "les protéines B sont plus petites que l'enzyme" on a répondu vrai car les protéines B se situent APRES l'activité enzymatique.
Je suis d'accord.Cependant je me demande si on peut étudier ces graphiques avec le même raisonnement.Je m'explique.

A la question " Les protéines de l'échantillon P3 ont le même poids moléculaire que les protéines notées C"nous avons répondu vrai car l'échantillon P3 proviennent de l'échantillon P2 filtrés sur gel donc par poids moléculaire.
Cependant,à la question "Les protéines de l'échantillon P3 ont un Point isoéléctrique différent des protéines C (graphe 3,filtration par affinité) j'ai répondu faux car je me suis dis:"les protéines en P3 proviennent indirectement de l'échantillon P1,or en P1,on a certainement trié par gradient de pH sachant que les protéines "attérissent toutes dans le même endroit" cela implique qu'elles ont le même pI,car si elles avaient un pI différents j'ai réalisé un graphique que vous trouverez dans l'encadré vert qui montre distinctement qu'elles n'ont pas le même pI"donc j'ai répondu faux, mais le prof a mis vrai...

J'ai besoin d'éclaircissement,du moins si vous avez compris mon problème lol,j'ai écris un long roman,j'en suis désolée mais chaque détail est important en concours...

Merci pour votre aide...
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[invite28fd8248]

Bonjour!

Alors,personne n'est inspiré par mes petits soucis?...

[invite28fd8248]

Désolée de relancer comme ça mais j'ai peur qu'on oublie de me répondre ...

[invite28fd8248]

vraiment AUCUNE question ne vous inspire???

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteecedecbd]

Bonjour

Un gradient de force ionique :
C'est une augmentation (généralement linéaire => gradient linéaire) de la concentration en sel (NaCl, ou autre).

Pourquoi il y a compétition avec du NaCl ?
En milieu aqueux (eau), les molécules de NaCl vont être dissociées et données des ions Na+ et Cl-. Donc dans le cas par exemple d'une chromatographie d'échange les ions Cl- vont rentrer en compétition avec la protéine chargée -.
Donc en augmentant progressivement la force ionique (augmentation quantité d'ions Cl- : compétition pour la phase stationnaire chargée +), tu vas élué progressivement les protéines.

Nature du tampon de chromatographie d'exlusion :
Généralement elle contient un tampon (maintenir le pH constant à une valeur donnée), une concentration en sel (généralement supérieure à 50mM pour éviter les intéractions entre la phase stationnaire et les protéines). Ensuite ton tampon peut contenir d'autres molécules mais là ça dépend de ton protocole.

Rôle du "substrat" libre dans une chromatographie d'affinité :
Tout d'abord attention à ton vocabulaire. Substrat est un terme réservé à de l'enzymologie pas à de la biochimie analytique. On parle de compétiteur, c'est une molécule qui a de l'affinité pour la phase stationnaire de la colonne d'affinité. On rajoute cette molécule pour éluer la protéine par compétition.

Augmentation de la concentration en NaCl :
Je sais trop qu'est ce que tu veux dire ici !!! Généralement pour ce type de chromatographie (surtout les IMAC) la concentration en NaCl des différents tampons est relativement élevée ([NaCl]>300 mmol/l). Cela permet d'augmenter la specifité, c'est a dire que seules les molécules (protéines généralement) ayant une forte affinité avec la colonne se fixeront sur cette dernière.
Ou bien si dans ton protocole (ex chromatographie d'affinité de Nickel) il élue la protéine en augmentant la force ionique c'est toujours le même principe c'est de la compétition

Ensuite pour ton QCM, il me semble que ton raisonnement est juste !!

Bon courage

Fabien

[invite28fd8248]

Bonjour Fabien!!

Je te remercie de m'avoir répondu!!En fait,j'ai eu TD de biochimie aujourd'hui du coup j'ai posé mes questions,et tu as confirmé les réponses que j'ai reçu...Pour le Nacl en chromatographie d'affinité:comme le substrat(si on veut éluer une protéine enzymatique)ou plus généralement la molécule située sur la résine en phase fixe,se fixe à la protéine à éluer par liaison faible,le NaCl peut "perturber " ces liaisons en se fixant sur la résine(par compétitivité) et permettant ainsi l'évacuation des protéines à éluer...c'est l'hypothèse que j'ai émise à mon prof de TD,il n'avait pas très sûr de lui mais m'a répondu que j'avais raison...quelqu'un pourrait-il me confirmer cela?

Merci!

[inviteecedecbd]

Re bonjour

Je suis pas sur que ton explication soit valable pour tous les types de chromatographies d'affinité !!! Dans le cas d'une IMAC oui je pense. Mais dans le cas de colonne de Glutathion sépharose par exemple, je pense pas que le NaCl rentre interragisse directement avec la colonne. Il doit plutot modifier l'intéraction GST-glutathion. Tout ceci est à verifier bien sur !!!!

Bon courage pour la suite