Problème de tranformation

[invite70228e15]

Bonjour à tous,

Je suis nouveau sur ce forum,et j'ai parcouru un peu les topics, je n'ai rien vu qui répondrai à ma question... Si le topic existe déjà, veuillez m'en excuser

Voilà je vous explique mon problème:

J'ai un gène (celui de l'IMPDH II humaine env. 1.5kb) que je voudrais transformer chez coli. J'ai tout d'abords utilisé le plasmide pcDNA5FRT (invitrogen) avec les souches DH5alpha. J'ai donc fait une PCR avec des primers pour l'IMPDH II contenant les séquences de restriction XhoI et Hind III sur de l'ADNc obtenu par RT sur les ARN totaux lymphocytaire (avec kit et RNA commandé chez invitrogen et pfX polymerase pour la PCR).

J'ai vérifié mon produit PCR sur gel, bande bien intense et à la bonne taille. J'ai ensuite fait ma digestion du pcDNA et de mon insert avec XhoI et Hind III, puis ma ligation. J'ai vérifié sur gel et purifié la bande contenant mon plasmide + insert (jusqu'ici tout va bien...)

J'ai ensuite fait ma transfo par heat shock avec mes DH5alpha compétente (tube neuf sorti du -80° dans la glace) et étalé sur boite LB amp.

Le lendemain, j'ai bien des colonies sur la boite (petites quand même... sauf quelques une); je repique les plus belles dans du LB amp. Et là, c'est le drame, rien ne pousse en milieu liquide alors que ça pousse sur la boite... J'ai répété l'opération plusieurs fois avec une 10aine de colonies à chaque fois, mais rien a faire, mes DH5 ne pousse que sur boite, pas en liquide.

J'ai donc changé de plasmide et de souches et utilisé TOPO-TA avec les bactos One-shot (tout chez invitrogen, encore...). même protocole sauf que j'ai utilisé la Taq en plus en fin de PCR pour rajouter les A nécessaire à la ligation dans TOPO et je n'ai pas digéré puisque la ligation se fait avec les poly A. Et la encore, après toute les vérification, j'ai des colonies sur ma boite (bcp de blanche et quelques bleus), mais aucune ne pousse lorsque je passe en milieu liquide (LBamp). Le plus intrigant, c'est que j'ai tenté de repiqué une bleu dans mon LB amp liquide, et là ça pousse nickel.

Je ne vois pas d'où peut venir le problème. Si vous l'avez déjà rencontré et surtout résolu, merci de me donner des pistes, car là, après avoir essayé plus de 5 fois sans résultat, je ne sais plus quoi faire.

Merci à tous ceux qui me lirons et me répondrons.

Cordialement

Yake
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[Yoyo]

salut

bizarre en effet. Tu devrais tenter de prendre le petites colonies plutot que les grosses. LEs DH5a sont des bacteries qui ne poussent pas tres vite, apres une nuit a 37 les clones sont petits.

A part une contamination je ne vois pas. Tu as tenté d'étalér tes bacteries non transformées sur LBA?

YOyo

[invite70228e15]

Oui j'ai essayé avec des clones plus petits, idem, ça ne pousse pas.

Mais j'ai peut être trouvé une explication, il semblerait en effet (en vu de ce que j'ai pu lire à droite à gauche) que mon AMP ne soit pas assez concentré sur mes boites ce qui ne suffit pas à faire la pression de sélection correctement et mes colonies perdent le plasmide. Ce qui expliquerai qu'elles ne poussent plus en milieu liquide + AMP. C'est pour moi l'explication la plus plausible vu que la seule colonie qui ai poussé en LBAMP liquide est ma TOPO bleu, donc ayant encore le plasmide...

J'espère que ce topic pourra être utile à d'autres personne ayant le même soucis. Et je viendrais vous informer du résultat une fois testé.

Cordialement

Yaké