Proposition d'expériences pour travaux futurs

[inviteae5af7c0]

Bonsoir à tous,

J'ai lu un papier à propos d'une méthode appellé "Ribosome engineering" qui consiste à muté des composants ribosomaux pour augmenter la production d'antibiotique chez S. coelicolor. Cela marche assez bien apparemment.

J'ai quelques questions par rapport aux futures recherche possible:

- Les souches mutantes obtenues présente une forte synthèse de ppGpp. Le gène codant pour cet enzyme à été identifier mais aucunes mutations n'ont été relevés. Je voudrai savoir comment la transcription de se gène peut être augmenté, ce qui est le cas.
J'ai pensé à une régulation positive via des protéines régulatrices. Dans ce cas là, je voudrai tagger l'ADN en question pour pouvoir récupérer le(s) proteine(s) interagissant avec ce gène (réaliser une sorte de chIP-chip). Es-ce faisable? Connaissez vous d'autre moyens plus simple/ mieux adapté?

- Ensuite, pour faire les ribosomes mutant, des antibiotiques ciblant les proteins ribosomales ou l'rRNA ont été utilisés (genre str, gen...). Je voudrai savoir pourquoi les mutations agissent préférentiellement au stade transcriptionnel. Comment expliquer cela?

Merci d'avance pour toute vos propositions
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[inviteae5af7c0]

Bon pour ce qui sont intéressés, voici l'article: http://www.pubmedcentral.nih.gov/art...?artid=2394871

Voilà où j'en suit en se moment pour la première question:

La sur-activation transcriptionnel d'un gène se résumerais à plusieurs hypothèses:

*soit à une mutation en CIS sur l'opérateur favorisant la fixation d'un activateur (facteur transcription par exemple) et/ou inhibant la fixation d'un répresseur;
*soit une mutation en TRANS touchant le répresseur et inhibant sa fixation sur le site opérateur;

*soit (et là je ne suit vraiment pas sûr), une mutation "positive" en CIS sur la séquence RBS (ribosomal binding site) de l'ARN où vient se fixer le ribosome.

Si une personne peut confirmer ou apporter d'autre(s) solution(s), je prends!

[inviteae5af7c0]

ptit UP please

[gorben]

Salut,

Il y a certains points qui sont plutot confus dans ton argumentation, notamment ce qui touche a l'alarmone ppGpp.

Il y a une "rubrique" journal club dans le forum et d'ici quelques jours il va y avoir un post sur la "reponse strigente". Je t'invite a le lire, il y a toutes les explications concernant l'alarmone ppGpp.

En attendant que tu lises ce post, pour faire vite sur le papier (j'ai pas lu en detail, juste tres rapidement) :

Ils utilisent une souche muti-resistante aux antibiotiques pour augmenter la biosynthese des antibiotiques. Ils "screen" des mutations du ribosome pour induire ce phenomene.

1/ l'alarmone ppGpp est augmentee, c'est relA dependant.

Jusque la rien d'etonnant. En ciblant le ribosome tu vas forcement deregler la fonction de relA qui est la proteine "sensor" du ribosome.


2/ Les manips de RT-PCR et de qPCR montrent que relA est augmente.

La par contre je n'y crois pas trop. Sur la RT-PCR qui n'est pas quantitative, on arrive a voir de fortes variations d'expression de leur gene de menage. Imagine ce que ca va donner en qPCR quand ils vont tout ramener au gene de menage.
Il faut garder a l'esprit que l'alarmone va toucher des centaines de gene dans la cellule. C'est un regulateur global du stress (voir 'journal club"). Du coup le choix du gene de menage doit etre tres tres tres etudie. Voila l'explication que j'ai trouve dans l'article quant au choix du gene : "The transcription of hrdB, a gene encoding the principal sigma factor of RNA polymerase, was used as the internal control." Bon ben voila, grave erreur. Le facteur sigma majeur est la cible prioritaire de l'alarmone. Des que ppGpp apparait, il y a une chute de l'expression du facteur sigma majeur, c'est la raison d'etre de l'alarmone.

En conclusion, la manip de quantification de relA n'est pas valide, tu peux meme considerer que le niveau de relA ne change pas. En diminuant la valeur du gene de menage, tu vas induire une fausse "sur-expression" de relA.

A mon avis ce qui se passe, c'est que le ribosome a accumule tellement de mutations qu'il n'est plus capable de traduire correctement, Il va etre plus lent, se tromper etc... Toutes ces erreurs vont induire une augmentation de l'activitee de relA, qui va produire l'alarmone, qui va rediriger l'ARN polymerase vers les genes de reponse aux stress qui sont (entre autres)... les genes de biosynthese des antibiotiques !

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteae5af7c0]

Merci pour l'explication Gorben, je pense y voire beaucoup plus clair maintenant!

Donc si j'ai bien compris, et que je prends en considération le papier que tu explique dans ton post sur la réponse stringente (bien fait au passage), ce qui est exposé dans l'article avec la mesure de l'expression de relA n'est pas super significatif.

La quantification de relA faite par les auteurs ne prouve en faite pas grand chose car le contrôle interne, hrdB, n'en n'est pas un car représente un gène de ménage ou promoter stringent donc forcément une cible de l'alarmone ppGpp, ce qui fait diminuer l'expression d'hrb après un stress.

En gros, ce n'est pas l'expression de relA qui augmente mais celle du "control" qui diminue. J'ai bon?

[gorben]

Salut,

Donc si j'ai bien compris, et que je prends en considération le papier que tu explique dans ton post sur la réponse stringente (bien fait au passage), ce qui est exposé dans l'article avec la mesure de l'expression de relA n'est pas super significatif.

La quantification de relA faite par les auteurs ne prouve en faite pas grand chose car le contrôle interne, hrdB, n'en n'est pas un car représente un gène de ménage ou promoter stringent donc forcément une cible de l'alarmone ppGpp, ce qui fait diminuer l'expression d'hrb après un stress.
En gros, ce n'est pas l'expression de relA qui augmente mais celle du "control" qui diminue. J'ai bon?

Oui voila c'est ca. Sans preuve comme quoi hrdB n'est pas controle par la reponse stringente (tres peu probable), le resultat de qPCR est a oublier. Ce n'est donc pas l'expression du gene relA qui change, mais l'activite de la proteine. En fait c'est probablement meme pas une augmentation de l'activite de la proteine, mais une stimulation normale de sa fonction du au stress provoque par les mutations.

A+

[inviteae5af7c0]

Salut,

Je voulais juste savoir comment un article comme cela peut-être publié s'il contient, le cas échéant, de si grosses erreurs de protocol qui invalide une bonne partie des résultats exposé dans l'article.
Je veux dire, un article doit sans doute être lu des tas de fois par pas mal de gens avant d'être accepté et de plus il est assez ressent (mai 2008 je crois) donc comment est-ce possible?

[gorben]

Salut,

Le truc c'est que chacun est "cloisonne" dans son monde. Quelqu'un travaillant sur les antibiotiques ne va pas avoir ni le temps ni l'envie de voir ce qui se passe au niveau de la reponse stringente (peu d'interet). Il arrive comme c'est le cas ici qu'apres une experience on trouve un truc interessant que l'on poursuit un petit peu. Le probleme c'est que c'est totalement hors du champ d'expertise. La strategie qPCR etait bonne, le facteur sigma majeur est un parfait controle interne puisque que son expression varie tres peu. Le seul probleme, c'est que dans precisement ce cas la, c'est le premier a varier, et le pire controle.

Pareil, quand tu soumets un papier, il va aller chez des reviewers specialistes du domaine principal (ici la resistance aux antibiotiques / biothechnologies), et ils peuvent eux aussi passer a cote d'un truc comme ca.

A+