Chromatographie d'exclusion sur colonne !

[inviteee0acec6]

Bonjour,

Je voudrais une précision concernant la chromatographie d'exclusion sur la colonne.

On a réalisé en TP une chromatographie d'exclusion sur colonne pour séparer 2 protéines (thyroglobuline, grosse protéine incolore et cytochrome C, moyenne protéine de couleur rouge) et un sel.

On récupère de cette colonne différentes fractions.

Après coloration par la méthode de Bradford (bleu de Comassie se colore en bleu en présence de protéines dans une solution acide) et mesure de l'absorbance du complexe formé à 600nm; on observe un pic d'absorbance pour la thyroglobuline et un pic pour le cytochrome C. Comment se fait-il que la thyroglobuline soit clairement présente dans un seul tube alors que le cytochrome C est totalement purifié au bout de 6 tubes (environ) ???

Ce que je ne comprend pas c'est que la thyroglobuline est éluée en premier car c'est une grosse protéine mais pourquoi est-elle présente dans une seul tube ?

Pour le cytochrome C, les protéines ne prennent-elles pas toutes le même chemin ? Ne devraient-on pas toutes les retrouver dans le même tube ?

Ma question est bizarre....mais si quelqu'un pouvait m'aider !
Merci !
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[Yoyo]

SAlut

Il est probable que ton cytC soit a la limite de la taille d'exclusion, ce qui fait qu'une portion de ta protéine va etre retenue dans la colone, ce qui fait que ton pic s'étale sur plusieurs fractions.

YOyo

[inviteecedecbd]

Bonjour

Je pense qu'on peut formuler plusieurs hypothèse concernant tes observations.

La thyroglobuline est peut être éluée dans une seule fraction du fait qu'elle soit exclue de ta colonne, c'est à dire que sa masse est tellement importante qu'elle ne pénètre pas dans les pores des billes et donc elle est très rapidement éluée en 1 seul bloc.

L'autre façon de voir les choses c'est que plus une protéine est en grande quantité plus elle va être éluée sur un nombre de fraction importante. Donc cela tu peux le vérifier puisque tu as fait des dosages par bradford. Regarde la concentration de chaque protéine dans chaque tube puis calcule la masse ou la quantité de chaque protéine.

Enfin la troisième hypothèse pour expliquer que le cytochrome soit élué dans différentes fractions, c'est que (il faudrait faire un peu de biblio car je ne suis pas spécialiste du cytochrome) le cytochrome peut être dans différents états oligomériques, donc les différentes formes seront éluées séquentiellement (de la plus grosse à la plus petite). Si ta colonne n'est pas suffisament résolutive, tu n'auras un pic pour chaque forme mais un gros pic !!!

Bon courage

Fabien

[inviteee0acec6]

Pour répondre à Yoyo, je ne suis pas à la limite de mon pouvoir de résolution de mon gel. Mon gel sépare des protéines de 1000 à 50000 Daltons (Da) et mon cytochrome C fait 12 000 Da environ.

Je ne pense pas que ce soit l'explication ! (mais merci)

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteee0acec6]

Je suis d'accord avec la seconde explication de Fabien 31...

Merci !

[invited972ca27]

Bonjour,

Je voudrais une précision concernant la chromatographie d'exclusion sur la colonne.

On a réalisé en TP une chromatographie d'exclusion sur colonne pour séparer 2 protéines (thyroglobuline, grosse protéine incolore et cytochrome C, moyenne protéine de couleur rouge) et un sel.

On récupère de cette colonne différentes fractions.

Après coloration par la méthode de Bradford (bleu de Comassie se colore en bleu en présence de protéines dans une solution acide) et mesure de l'absorbance du complexe formé à 595nm

Bonjour,
Une autre question
J'ai fait, à peu de choses près, le même tp.
On veut détecter les protéines par la méthode de Bradford.

On a fait une gamme étalon de l'absorbance de BSA colorée au réactif de Bradford : mais c'est quoi le BSA ? quelle est son utilité ? il est censé "représenter" une protéine ?

A partir de cette gamme étalon, on fait une courbe étalon Abs=f(quantité de protéines)

Puis on revient au fractions de notre expérience : on y ajoute du réactif de Bradford, et on mesure l'absorbance à 595 nm de chaque fraction.
On nous demande de calculer la quantité de protéines dans chaque fraction, et d'expliquer le calcul....

Je ne comprends pas comment la calculer, je pensais juste trouver les résultats grâce à la courbe étalon (sinon à quoi elle sert?), mais à priori ce n'est pas comme ça.

Quelqu'un a une idée du calcul à utiliser ?
Merci par avance