Isolé un gène d'une bactérie thermophile inconnue

[inviteb8cec158]

Bonjour,

je cherche comment m'y prendre pour isoler le gène d'une ADN polymérase du bactérie thermophile d'une espece inconnue.

Je sais qu'une DNA Pol est tres conservé d'un organisme à l'autre, donc je prendrais le gène de la DNA pol de la Tac comme sonde pour hybridation.


C'Est ensuite que je suis bloqué:
dois-je fais une banque avec digestion complete ou partielle

S'y j'en fais une partielle, je vais obtenir une "smear" sur mon gel.
Comme je fais pour obtenir des fragments et ensuite les hybrider
Merci
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[Yoyo]

Salut

si tu travailles a partir d'une espece dont le génome n'est pas connue. Tu prends des especes proches, tu alignes les polymérases et définis des motifs les plus conservés possibles et les plus spécifiques possibles de ton enzyme. Tu dessines des amorces dégénérées (prenant en compte la dégénérescence du code génétique) et tu fais une PCR.
Si tout se passe bien tu obtiens une bande correspondant a ton gène. Apres il ne te reste plus qu'a le cloner pour le séquencer.

YOyo

[inviteb8cec158]

Mais est-ce que je dois préalablement digérer le génome avec un enzyme de restriction et faire une banque et si non, pourquoi.

Pour ce qui est des amorces, dois-je les disigner en amont du ATG et en aval du codon de terminaison car les promoteurs sont petit et les RBS varient beaucoup
Merci encore

[Yoyo]

salut

non pour la digestion, pou rl'utre question relis ce que j'ai écrit tu trouveras la réponse.
YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb8cec158]

Rebonjour,
On ne pourrais pas utiliser une approche phénotypique du genre établire une banque génomique complète avec digestion partielle et cloner dans E.colie et faire pousser a 42 degré centigral compte tenu que c'est un gène d'une ADN polymérase thermophile

Merci encore

[Josquin]

thermophile... mais à 42°C c'est pas hyper chaud...! et puis E. coli va se contenter de répliquer l'ADN archéen, en se fichant pas mal de savoir ce qu'il code : elle a tout ce qu'il faut pour se développer, et ne va pas s'embêter à synthétiser une autre polymérase, qui ne marcherait sans doute pas dans une bactérie si éloignée phylogénétiquement. Il me semble, en tout cas !

Je pense que l'idée des comparaisons de séquences avec des archées connues est la meilleure. tu as pas la protéine, j'imagine.

Bon courgae !

Josquin

[MaliciaR]

Salut,

Euh, pour faire un crible sur un gène essentiel... Bonjour la prise de tête. Tu voudrais ptet le cloner sous le contrôle d'un promoteur thermosensible et des trucs du genre?

Perso, je trouve que l'approche proposée plus haut est nettement meilleure. Après, une fois le gène natif obtenu par PCR, tu peux t'amuser à voir s'il complémente des coli à des T°C diverses et variées, ou tout un tas de ces choses très chouettes qu'on fait à la paillasse