Démonstration du role d'un miRNA in-vivo

[Yoyo]

Bonjour

Je cherche une référence décrivant précisément le rôle d'un miRNA dans la régulation d'un gène (peu importe le gène). En fait j'aimerai savoir comment ont démontre précisément qu'un gène est régulé par un miRNA donné. Car en gros, on trouve plein de données de séquençage massif, d'expression etc... mais quant à démontrer formellement une fonction ca reste tres flou, et nettement pas vraiment spécialiste des miRNA je nage dans l'abondante bibliographie .
Dernier détail, Si ca pouvait être dans un des trois organismes donnés (C. elegans, Homme, souris) ca serait parfait.

Merci d'avance a nos pros des miRNA qui seront me conseiller le bon article

YOyo
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[Yoyo]

juste pour préciser (car ce n'est pas tres clair) qu'une référence d'un article me conviens tres bien. Je me débrouillerai ensuite pour récupérer l'article.

MErci par avance.
Yoyo

[LXR]

Je connais très peu les miRNAs. Par contre j'ai une petite idée (à défaut de référence), je pense qu'il est possible d'agir comme pour l'invalidation d'un gène par KO. Le principe est le même, la forme expérimentale est évidemment un peu différente. Etant donné qu'un miRNA est constitué de deux séquences complémentaires, avec entre elles un espace (boucle), il s'agirait juste de faire de la mutagenèse dirigée : tu mute une des deux séquences complémentaires pour qu'elle ne puisse plus s'hybrider à la deuxième. Ainsi le miRNA ne peut plus former un hairpin après transcription. Il n'est donc plus reconnu, ni maturé par les systèmes protéique dédiés : il est invalidé. L'identification du ou des gènes régulés par le miRNA peut se déduire grâce au phénotype observé, ce qui limite le champ.
En connaissant la séquence du miRNA, ne peux-tu pas la blaster pour savoir à quelle séquence elle est complémentaire ou "identique"?

Mon idée est probablement foireuse car je ne suis pas spécialiste de ce domaine, mais ça peut déboucher sur autre chose. Une invalidation de miRNA est sans doute moins violente au niveau phénotypique qu'un gène, étant donné que ce sont des outils naturels de régulation avant tout, donc l'invalidation n'est peut être pas la méthode de choix.

Greg

NB : Dans les découvertes de miRNA, il ne leur est pas demandé d'invalider le miRNA pour confirmer sa fonction?

[Yoyo]

bonsoir

merci pour ta réponse. En fait le probleme d'inactiver un miRNA est assez complexe. Tu peux le muter et exprimer cette version mutante à partir d'un plasmide. Mais comment tu inactives la copie chromosique?
Deuxieme probleme, visiblement les miRNA ont de multiples cibles potentielles. Ce que j'aimerai c'est montrer que mon gène d'intéret est ou non réguler par miRNA.

Pas simple de trouver comment faire...
YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[LXR]

comment tu inactives la copie chromosique?

Justement, par mutagenèse dirigée, avec la même procédure utilisée pour réaliser des souris KO à partir de cellules ES. Vecteur possédant la séquence à insérer avec partie flanquantes homologues à la partie amont/aval du site de recombinaison, et suivant la séquence mutée un gène codant une résistance pour faciliter la sélection des recombinants (Neomycine utilisée la plupart du temps). Si tu as une idée d'un miRNA régulant ton gène, cela pourrait servir de confirmation, certes lourde au niveau expérimental.

Les miRNA ont parfois plusieurs cibles en effet. En plus ils peuvent agir sur toutes (sinon un grand nombre) les étapes de la traduction. Un ami travaillait sur la régulation d'une IRES par un miRNA, il connait certainement des méthodologies particulières, je le contacte!

Greg

[Yoyo]

J

Les miRNA ont parfois plusieurs cibles en effet. En plus ils peuvent agir sur toutes (sinon un grand nombre) les étapes de la traduction. Un ami travaillait sur la régulation d'une IRES par un miRNA, il connait certainement des méthodologies particulières, je le contacte!

Greg

Merci!

En effet ca me parait super lourd. Et encore je n'aurai que des correlations aucune preuves directes.
J'ai l'impression qu'on en est aux année 70 de la génétique, ou on observait des corrélations mais on ne pouvait pas aller plus loin...

yoyo

[LXR]

J'ai l'impression qu'on en est aux année 70 de la génétique, ou on observait des corrélations mais on ne pouvait pas aller plus loin...

yoyo

Oui parfois la biologie actuelle déçoit par son manque de finalité mais il faut dire qu"un grand nombre de systèmes de régulations ont été découvert. On se rend compte qu'ils s'opposent, se stimulent et cela de manière intégrée par rapport à l'ensemble. Pour faire la part des choses et imaginer ce qu'il se passe réellement in vivo, c'est loin d'être gagné...Il faudra bien un jour faire appel à de nouvelles technologies (IA, ordinateur quantique,...) pour s'en sortir, cela ferait d'ailleurs l'objet d'un bon débat.

En attendant la réponse de mon collègue,



Greg

[gorben]

Salut,

J'imagine que tout depends de ce que tu veux faire des resultats, mais tu peux deja surexprimer le miRNA et suivre l'evolution de ta proteine d'interet. Si c'est negatif tu ne peux rien conclure et tu vas devoir en passer par des mutants, mais si c'est positif ca reponds a ta question.

Si tu suspectes une interraction directe, pourquoi pas faire l'etude in vitro?

A+

[Yoyo]

Salut

Merci pour tes suggestions gorben. La surexpression d'un miRNA qui peut potentiellement cibler d'autres mRNA risque d'avoir des multitudes de phénotypes sans qu'il soit possible de différencier lesquels sont liés au gène que j'étudie.

Tu penses a quoi comme manip in vitro?

YOyo

[invite160a5434]

Bonjour,

C'est un grand moment, nous allons tenter d'aider celui qui d'habitude, aide tout le monde.

Je vais essayer de te donner deux ou trois éléments de mon cours sur l'interférence d'ARN, en espérant que ça puisse t'aider.
En revanche, si c'est un peu creux, c'est normal, je ne trouvais pas le sujet interessant ...

Dans mon cours ils ont fait les constatations suivantes, c'est chez le pétunia : ils ont surexprimé le gene d'interet et sur northernblot, ils ont vu qu'il y avait une diminution de la quantité d'ARN.
En parallèle, ils ont fait un Run on ou ils ont observé qu'il y avait une surexpression de l'ARNm ...

Donc en fait ils ont confirmer par la suite ils ont fait des expériences avec l'ARN sens seul, l'antisens seul, ou les deux, et montré la dégradation hypothétique sur agarose 10%.

Est ce que tu as cherché des articles sur les ARN antisens les plus célèbres genre let7 chez C.elegans dans el developpement ?

Bonne chance

[Yoyo]

Merci T0yt0y pour ton aide.

J'ai regardé pas mal d'article, mais malheureusement sans grand interet (pour ma question).

YOyo

[gorben]

Salut

Merci pour tes suggestions gorben. La surexpression d'un miRNA qui peut potentiellement cibler d'autres mRNA risque d'avoir des multitudes de phénotypes sans qu'il soit possible de différencier lesquels sont liés au gène que j'étudie.

Tu penses a quoi comme manip in vitro?

YOyo

Donc en fait ce que tu cherches c'est a mettre en evidence une interaction directe entre ton gene et ton miRNA, pas de savoir si ton gene est regule par le miRNA?

Dans ce cas, je ne suis pas sur qu'il y ai une facon facile de mettre ca en evidence in vivo.

A mon avis la meilleur methode c'est : tu le surexprimes (ou le delete) et tu contastes un phenotype, conclusion : Oui le miRNA affecte mon gene.
Et tu demontres in vitro une interaction : RNA shift, protection S1 etc... Pas facile, mais bon... vive la bio
Perso ce que je ferais, c'est deja essayer en premier lieu un RNA shift avec du "crude extract" provenant d'une lignee wt vs une lignee delta une des proteines du complexe "RISK" (si une telle lignee existe). C'est rapide et ca donne deja une idee avant de faire du vrai in vitro.

Sinon j'ai trouve ce papier, tu l'avais deja vu? J'ai regarde les figures vite fait, et ca a l'air de correspondre...

A+

[Yoyo]

Salut

Merci Gorben pour le papier, non je ne l'avais pas vu, je vais le lire.

Mais je me rends compte que je n'ai pas forcément expliqué tres clairement ce que je voulais faire.

Je m'interesse a un gene "YFG" et je me dis: "tiens pourrait-il etre soumis a une régulation par miRNA chez elegans, ou l'homme?"

alors je consulte les bases de données, miRANDA, miRFINDER etc... pas simple car cela te sort des listes completes de miRNA candidats potentiels. Bon en tenant compte de la conservation au travers des différents génomes il ne m'en reste plus qu'un ou deux qui matchent dans mon 3'UTR.

D'apres les bases les miR en question ont été validés expérimentalement (ils sont donc exprimés) mais ils ont de multiples sites dans le génome (ils peuvent s'apparier sur plusieurs 3'UTR différents).
Et c'est la que je me dis..."hey mon coco tu fais comment pour valider cela expérimentalement ?"

Merci pour votre aide.
YOyo

[invite30157012]

Salut Yoyo
En effet étudier l'effet d'un miRNA sur un mRNA donné ce n'est pas simple, pour toutes les raisons qui ont été évoquées. Muter le miRNA comme on le ferait pour un siRNA ne me semble pas judicieux car la particularité des miRNAs est justement d'avoir des mésappariements avec la séquence cible. De plus il existe souvent de multiples copies du miRNA et des miRNAs de la même famille dans le génôme, et il y a donc un effet de redondance...
Voilà ce qui est fait en général dans les articles qui veulent démontrer qu'un mRNA est bien la cible d'un miRNA donné:
1. surexprimer le miRNA (tu vérifies que tu as bien surexpression par qPCR), et regarder si cela a un effet sur ta quantité de protéine en WB; et si oui si tu as un phénotype lié. En général, ils montrent que la protéine est diminuée mais pas l'ARNm, encore caractéristique de l'action des miRNAs ou l'ARNm n'est pas dégradé mais simplement pas traduit... (en général...!). Tu peux aussi introduire ta protéine avec un 3'UTR muté dans la séquence cible du miRNA et voir si tu récupères un phénotype "normal"
2. utliser un antagomir de ton miRNA (antisens qui inhibe ton miRNA); et regarder ta protéine et ton phénotype;
3. valider ta séquence cible en clonant le 3'UTR de ton gène dans un reporter luciferase que tu transfectes avec ton miRNA d'une part et des miRNAs contrôles d'autre part, et tu valides ta cible dans ton 3'UTR en mesurant l'activité luciferase.
Voici des articles qui font ce genre de manips:
Nature 456, 980-984
Cancer res 2008; 68 (8); 2587-2591
Nature 455, 1124-1129
Nat cell biol 9 (7), 775-787
J'ai pris un peu ceux qui me tombaient sous la main mais si tu en as besoin d'autres il y en a pas mal, je peux chercher, et si tu as besoin de précisions, n'hésites pas! Bon courage

Delphine

[invite30157012]

OU encore cet article que je n'ai pas lu en détail mais qui vient de sortir et qui semble correspondre à ce type de démonstration également:
http://www.pnas.org/content/106/17/7113.abstract?etoc

[Yoyo]

salut

merci beaucoup Delphinette pour ton aide et tes suggestions, je vais regarder les papiers que tu donnes.

YOyo

[invite17a570c1]

Hello,

3. valider ta séquence cible en clonant le 3'UTR de ton gène dans un reporter luciferase que tu transfectes avec ton miRNA d'une part et des miRNAs contrôles d'autre part, et tu valides ta cible dans ton 3'UTR en mesurant l'activité luciferase.

J'avais entendu un truc semblable aussi. Ou carrément en fait muter les sites de reconnaissance putatifs dans les 3'UTR et voir le résultat.
Je n'ai pas eu le temps de le lire, mais regarde cet article, il peut ptet t'apporter des infos supplémentaires.

[gorben]

Salut,

1. surexprimer le miRNA (tu vérifies que tu as bien surexpression par qPCR), et regarder si cela a un effet sur ta quantité de protéine en WB; et si oui si tu as un phénotype lié. En général, ils montrent que la protéine est diminuée mais pas l'ARNm, encore caractéristique de l'action des miRNAs ou l'ARNm n'est pas dégradé mais simplement pas traduit... (en général...!). Tu peux aussi introduire ta protéine avec un 3'UTR muté dans la séquence cible du miRNA et voir si tu récupères un phénotype "normal"
2. utliser un antagomir de ton miRNA (antisens qui inhibe ton miRNA); et regarder ta protéine et ton phénotype;
3. valider ta séquence cible en clonant le 3'UTR de ton gène dans un reporter luciferase que tu transfectes avec ton miRNA d'une part et des miRNAs contrôles d'autre part, et tu valides ta cible dans ton 3'UTR en mesurant l'activité luciferase.

Le probleme, c'est que toutes ces manips vont amener a une seule conclusion : Oui le miRNA est implique dans la regulation du gene YFG. Tu auras une grosse idee si c'est direct ou indirect, mais aucune preuve. A mon avis le seul moyen de montrer une regulation directe est in-vitro. Sans in vitro ce n'est que supposition et deduction.
En tout cas, tous les papiers que j'ai pu lire sur des regulations on toujours les deux parties (a part si c'est pour publier des resultats preliminaires).

a+

[Yoyo]

Salut

Je suis d'accord avec toi gorben, je pense aussi qu'un complément de manip in-vitro est necessaire. Mais je pense aussi qu'in vitro les résultats peuvent etre tres biaisés.

YOyo