FACS/cytométrie de flux et interactions cellulaires

[invited44f9514]

Bonjour !

Je suis en train de bosser sur des résultats d'analyses par cytométrie de flux (FACS) d'échantillons de sang périphérique humain.
Les cellules immunitaires ont été isolées par gradient de ficoll, nous sommes donc en présence de suspensions cellulaires comportant des lymphocytes T, B, des Natural Killer...etc

L'analyse porte sur différents marqueurs permettant une identification des populations en présence, et de leur(s) état(s) d'activation, et ce par simple ou double marquage.

Ma question est la suivante :

Des cellules en interaction dans la suspension peuvent-elles le rester lors de la stimulation par laser au sein du FACS ?

Cela expliquerait qq double positifs étonnants que j'observe, donc si un habitué du FACS et/ou de l'immuno passe par là...

merci !
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[sansplomb]

Bonjour,

Difficile à dire. D'une part les cellules subissent une accélération avant le passage dans le faisceau laser et d'autre part il est impossible de distinguer un doublet (un simple agrégat) de deux cellules qui interagissent.
Est ce que le marquage persiste si vous enlevez les doublets en montant un dot plot avec FSC-H ou A versus un width?.

cordialement

[invited44f9514]

Bonjour,

Il y a donc de vrais spécialistes !

J'aimerais répondre à cette question, mais je ne la comprends pas !

Je peux néanmoins essayer d'apporter qq précisions ;

J'obtiens des double positifs qui ne peuvent exister dans du sang périphérique humain, ex : CD4+/CD8+ (seul cas possible: des thymocytes en cours de maturation, mais dans le thymus !).
Autre ex: CD4+/CD20+.CD20 est un marqueur des lymphocytes B, et CD4 des LT helper...J'imagine donc des agrégats/interactions cellulaires, ou une mauvaise lecture des nuages de points !

Je vais tacher de mettre qq résultats en ligne, pour confirmer ou infirmer ma lecture.

Merci de votre attention

[invite30157012]

Bonjour
Je ne m'y connais pas en immuno et tes résultats ne sont pas encore accessibles mais en effet quand on analyse au FACS on élimine d'abord les doublets en faisant un plot de FL2-W en fonction de FL2-A (ou FL2-H que j'utilise comme détecteur pour le PI pour le cycle)... Ceci te permet d'éliminer ce qui a été compté comme un évènement alorsq 'uil s'agit de 2 cellules collées.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited44f9514]

Bonjour Delphinette,

Je ne pense pas que de telles précautions aient été prises, il s'agit en effet d'un "simple" TP, dont le but semble être à la fois l'approche de cette technologie (FACS) et la pratique en immuno.

Ce que tu appelles "doublet" est donc qq chose de courant ? Si oui des cellules en interaction spécifique peuvent peut-être le rester pendant l'analyse optique ?

Vos précisions me dessinent une critique du TP que les encadrants attendent peut-être, à savoir qu'une précaution anti-doublets aurait pu être mise en place.

De plus, mm si qq double positifs me mettent le doute quant à leur probabilité, d'autres semblent révéler des interactions déjà bien connues (LB/LT CD4+ par ex).

Merci pour vos réponses rapides, en espérant que la mise à disposition de mes documents le soit tout autant

[JPL]

Peux-tu donner la source de ces graphiques ? En effet la charte du forum dit :

Ne vous appropriez pas les informations d'autrui, citez vos sources.

[invited44f9514]

Bonjour JPL,

Comme précisé dans la discution, ces graphiques sont le résultats de mes manip effectuées lors d'un TP, et donc de mon travail.

Je n'ai effectivement pas lu la charte avant de poster, c'est un peu dans l'urgence que j'appelle à l'aide !

J'espère que cette réponse suffit, je ne vois pas comment prouver l'origine de ces résultats...

[sansplomb]

Bonjour,

Votre problème est plus basique, il n`y a aucune analyse. Ceux sont des datas bruts, même pas compensées (overlap du FITC dans le canal PE et inversement). Pas de gate morphologique pour enlever les débris cellulaires, pas de marquage de l`apoptose.
difficile dans ces conditions de regarder les cellules doublement marquées.
néanmoins, il y a beaucoup de discussion en cytometrie pour savoir si cette population CD4+CD8+ existe. Certains disent qu`il s`agit de doublets (on peut tenter de le vérifier en diminuant la vitesse d`acquisition), du marquage non spécifique des cellules apoptotiques (intérêt de mettre un marqueur d`apoptose et de faire des régions morphologiques). d`autres, notent que cette population pourrait être une vrai population, notamment dans le cas des infections HIV. Il existe des références dans ce sens. Un moyen de vérifier serait d`isoler cette population et de regarder ensuite la persistance du double marquage ou pas.

Cordialement

[invited44f9514]

Effectivement, je pense qu'aucune compensation n'a été effectuée.

Mon problème réside bien dans le fait que ces résultats nous sont transmis sans plus de détails quant aux réglages effectués pour l'acquisition des données.

Merci pour votre rapidité de réponse sansplomb, ainsi qu'au modo !