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Probleme purification sur gel d'agarose

  1. #1
    Pavel

    Probleme purification sur gel d'agarose

    Bonjour,

    Je suis nouveau sur ce forum et fais appel a vous car je commence a desesperer...

    Voila cela fait plusieurs fois que j'essaie de purifier une bande sur gel d'agarose sans succes.
    Pour plus de precisions, je digere mon plasmide (50 microgrames) qui fais environ 10kb, afin d'exciser une bande a 300pb. Lorsque je fais migrer sur le gel, je vois parfaitement cette bande (qui doit logiquement contenir 1.2microgrammes d'ADN).

    J'utilise le kit QIAquick gel extraction de chez Qiagen et suis le protocole a la lettre. Probeme: je n'ai pas d'ADN dans mon eluat...

    Quelqu'un aurait il une idee car la je n'en peux plus!
    Merci d'avance!

    Pavel

    -----


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  3. #2
    Zellus

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Salut Pavel ! Bienvenue sur Futura !

    qui doit logiquement contenir 1.2microgrammes d'ADN
    1,5 mg plutôt non ?

    Quelqu'un aurait il une idee car la je n'en peux plus!
    C'est assez difficile à dire comme ça ...
    Tu es sûr qu'il y a de l'éthanol dans ton tampon PE ?
    Tu utilises un gel d'agarose de plus de 2% d'agarose ?
    Tu utilises de l'isopropanol ?
    Le mieux serait peut-être que tu nous dises exactement tout ce que tu fais (volume utilisés ...). Ca pourrait peut-être davantage aider à cerner le problème ...

  4. #3
    Pavel

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Merci pour ta reponse.

    Tout d'abord la quantite d'ADN dans ma bande est autour de 1 micrograme ce qui elimine toute possibilite de surcharge de la colone (dont la limite est 10 microg)

    Apres avoir decoupe ma bande je la pese : 220g (le gel etait a 0.9%)
    Je reprend dans 3vol de tampon QG (soit 660microL) pendant 10min a 50 degres (en vortexant toutes les 2min)

    Apres cette etape mon gel est bien dissoud, je charge la colone avec cette solution (qui est au bon pH car il y a un indicatif de couleur) contenant mon adn je centrifuge 1min 16g a temperature ambiante.

    Je jette le surnageant et recharge la colone avec 500microL de QG. Re-centri

    750microL de tampon de lavage PE (avec l'ethanol, je confirme rien qu'a l'odeur!)
    Re-centri

    Elution dans 30microL de tampon (dont je n'ai pas verifier le pH d'ailleurs) puis desespoir! Rien dans mon tube!

    Est ce qu'avec ces details quelqu'un aurait une idee??

    Pavel

  5. #4
    Pavel

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Oups pour le poids du gel je parle evidemment en mg pas en g!!

  6. #5
    Pavel

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Re-oups

    Apres avoir dissoud mon gel dans le QG, je rajoute un vol de Gel en isopropanol (soit 220mL), promis cette fois j'ai tout dis!

  7. #6
    Zellus

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Oups pour le poids du gel je parle evidemment en mg pas en g!!
    Oué moi aussi je me suis planté. Je voulais dire 1,5 μg.

    Sinon tu recentrifuges 1 min après t'être débarassé du PE ? Je ne sais pas si c'est très gênant mais on sait jamais ...
    Tu attends au moins 1 min avant d'éluer quand tu rajoutes ton tampon ?
    C'est quoi d'ailleurs le tampon que tu utilises ?

  8. #7
    Pavel

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Oui j'ai recentrifuger apres le PE et j'ai attendu 1min avant de centrifuger pour l'elution. Le tampon d'elution est celui du kit, j'imagine que c'est du TE a pH8,5.
    Est il possible que des centrifugations a des vitesses trop fortes puissent affecter la liaison de l'ADN a la colone??? Je suis pas tres convaincu mais au point ou j'en suis!

  9. #8
    Zellus

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Pourquoi tu centrifuges à quelle vitesse ?

  10. #9
    Pavel

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    a 13200rpm ce qui fait plus de 16000g sur ma centri de paillasse. Mais c'est ce qu'ils recommandent dans le kit...

  11. #10
    Zellus

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Ok moi je fais pareil et ça marche très bien donc ton problème doit venir d'ailleurs ...

  12. #11
    Yoyo

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Salut

    tu as l'air de tout faire correctement... mon conseil serait d'ouvrir un kit nuef et de preparer toi meme le PE. et de prendre de nouvelles colones, il m'est arrivé des trucs bizarres avec certaines. Quand tu rajoutes ton tampon d'élution, il s'absorbe correctement sur la membrane?

    Moi j'élue deux fois de suite pour récupérer le plus possible d'ADN, et perso je trouve que les kits de chez in vitrogene marchent 10x mieux.

    Bon courage
    YOYo

  13. #12
    maxlebricolo

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Bonjourno,
    je voulais juste savoir si le problème avait été résolu car, ayant eu le même, je peux peut être donner des conseils sur ce que j'ai testé?
    a+

  14. #13
    LXR

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

    Partages tout de même ton expérience, ça ne fais pas de mal et ça peut servir à quelqu'un passant par là.

    Greg

  15. #14
    maxlebricolo

    Re : Probleme purification sur gel d'agarose

    Bien alors pour ma part, je dois dire que j'ai pas mal fait de test mais, aucun n'a été LA révélation. J'ai juste un peu amélioré le rendement c'est tout.

    Ce qui a été le plus efficace c'est de rajouter du NaoAc en grande quantité. En effet, le pH du TBE était trop élevé du coup la perte était maximale. Le mieux que j'ai obtenu a été de mettre 15µl de NaoAc pour 100mg de gel coupé.

    Par contre, la vitesse de centrifugation ne change rien du tout sur le rendement, et la deuxième étape de 1minute après PE ne sert que pour éviter d'avoir des traces d'éthanol dans l'éluat.

    Voilà c'est tout mais je reste toujours curieux de savoir s'il y a une solution miracle.

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