Problème de construction d'une banque d'ADNc

[inviteea23feb0]

Bonsoir à toutes et à tous

En vue de construire une banque cDNA j'avais recours au kit Creator™ SMART™ cDNA Library Construction Kit.
Mais, j'ai rencontré des problèmes lors du clonage...

En fait, j'ai vérifié toutes les étapes depuis l'extraction de l'ARN jusqu'au fractionnement... j'ai aussi vérifié la compétence de mes cellules... >>> toujours aucune colonies sur boite

Je tiens à vous dire que pour digérer mes fragments j'utilise l'enzyme de restriction Sfi I et ce à 50°C pendant 2h.
Le vecteur est commercialisé sous sa forme linéaire doublement digéré par Sfi I et déphosphorylé.
J'ai essayé diverses proportions insert vecteur, et toujours rien.
J'ai même changé de ligase et toujours pas de résultats....

Je désespère... à l'aide SVP

Merci.

La prochaine fois, veuillez mettre un titre explicite c'est à dire en Français vu que nous sommes sur un forum francophone : Charte.

LXR
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[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura,

Est-ce que vous rajoutez bien la BSA qui est nécessaire pour un clivage optimal par Sfi1? Quel contrôles intra-manip avec vous fait (contrôle de clivage par l'enzyme, de recircularisation du vecteur,...)? Quelles bactéries utilisez-vous pour la transformation? Avez-vous fait le contrôle de base nécessaire sur la transformation des bactéries : transformation avec un plasmide contrôle?

Greg

[inviteea23feb0]

Bonjour et bienvenue sur Futura,

Est-ce que vous rajoutez bien la BSA qui est nécessaire pour un clivage optimal par Sfi1? Quel contrôles intra-manip avec vous fait (contrôle de clivage par l'enzyme, de recircularisation du vecteur,...)? Quelles bactéries utilisez-vous pour la transformation? Avez-vous fait le contrôle de base nécessaire sur la transformation des bactéries : transformation avec un plasmide contrôle?

Greg

Bonjour et merci pour votre réponse

Oui je met la BSA dans le milieu réactionnel de la digestion.
En ce qui concerne le vecteur, il est commercialisé sous sa forme digéré par Sfi I donc je ne peux pas le recirculariser.... j'ai déjà vérifié qu'il est sous sa forme linéaire par migration sur gel d'agarose.
J'ai utilisé les bactéries electro et thermocompétentes et je les ai vérifié (la compétence) par des plasmides tests... elles sont compétentes...

PS : j'ai une petite question un peu bête, mais c'est juste pour vérifier : y a t il une manip à faire nous permettant de vérifier si l'ADNc est digéré par Sfi I ou pas ?

J'ai oublié de mentionner qu'avec le kit on nous a fournit un insert test qui lui aussi est préalablement digéré par Sfi I après ligation avec le vecteur aucune colonie sur boite n'est détectée!!!

[LXR]

Donc c'est certainement l'étape de ligation qui bloque, comme c'est souvent le cas dans ce genre d'expérience.

La vérification du clivage des ADNc par une enzyme de restriction peut se faire si le clivage génère des fragments de taille différente et suffisamment longs. Ainsi par migration sur gel d'agarose, la présence des bandes d'intérêt permet de valider le clivage.

Pour l'étape de ligation, quelle quantité de vecteur utilises-tu? Quels rapports vecteur:insert? Quelle quantité de ligase (Unité et volume)? Quel volume final représente le milieu réactionnel de ligation? Combien de temps incubes-tu? A quelle température? Quel volume de produit de ligation utilises-tu pour transformer tes bactéries?

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteea23feb0]

Apparemment c'est la ligation qui bloque... en utilisant une ligase différente de celle du kit et en étalant les cellules après centrifugation (concentrées) je me suis rendue compte qu'il y a des colonies sur ma boite...
Le problème maintenant comment faire la titration autrement dit comment pourrait déterminer le nombre de CFU / mL ?

Réponses aux questions (qui seront peut être utiles) :
vecteur : 100 ng
ration insert vecteur : 1/1, 3/1, 6/1
ligase (promega) : 1µl
volume de ligation : 5 µl ou 10 µl
temps et température d'incubation : overnight 4°C
volume de produit de ligation : 5 µl pour transformer 200 µl cellules thermocompétentes.

Merci pour votre aide...

[LXR]

L'ensemble me parait bien. Pour la ligase que tu utilises, 1 µl correspond à combien d'unités? Pour ma part, ce qui marchait pour un sous-clonage était un rapport 3:1 (insert:vecteur) avec 300 ng de vecteur, 200 U de ligase fraîchement entamée, overnight à température ambiante. Puis transformation de 20 µl de bactéries chimiocompétentes avec 8 µl de produit de ligation. Ca marche très bien mais tes conditions semblent assez proches, tu dis qu'une autre ligase a donné les premiers résultats donc c'est sur la bonne voie.

Pour déterminer approximativement le nombre de bactéries transformées dans un volume donné, tu ensemences un volume donné de ta suspension bactérienne. Après étalement sur boite tu comptes le nombre de colonies formées et tu en déduis le nombre de bactéries transformés dans ta suspension en le multipliant par le facteur volume total/volume prélevé, tout simplement.

Greg

[inviteea23feb0]

Merci infiniment Greg
Pour la ligase c'est 1 U Weiss

[LXR]

C'est très peu... Moi j'utilisais 200 U, et le fournisseur de la ligase utilisée (New England Biolabs) préconise 400 U. Si ça fonctionne mal à nouveau, essaye avec ce nombre d'unités de ligase et ça devrait aller mieux.

Greg