tampon de lyse
bonjour à tous,
juste une petite question , je travaille sur des cellules 293-t et lorsque je lyse certaines protéines restent insolubles, quelqu'un aurait-il une idée pour un tampon amélioré qui me permettrait de solubiliser ces protéines en vu du western?
Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,
Qu'est ce qui te fait dire que tes protéines d'intérêt ne sont pas solubilisées par le tampon de lyse? Les protéines que tu regardes sont-elles membranaires, localisées dans un sous-compartiment cellulaire particulier, les surexprimes-tu? Comment lyses-tu tes cellules (composition tampon, étapes physiques de lyse (choc thermique, piston Dounce, vortex, sonication,...))?
Greg
Dernière modification par LXR ; 16/08/2009 à 15h20.
Re : tampon de lyse
bonjour et merci!
je cherche à quantifier l'expression d'un récepteur membranaire (cd28) par western après transfection des cellules 293t, dans le but de valider des essais d'interaction prot/recep.
Et j'utilise un tampon composée de: 50mM tris-hcl ph8, 150mM NaCl, 0,02% de sodium azide et 1% de triton en ajoutant un cocktail d'inhibiteur de protéines.
....au final le cd28 ne se solubilise pas (il n'apparaît pas dans le western mais je peut le voir en micro scopie cofonc)... des idées?
merci encore
.... et j'oubliais, je lyse sur glace 20 min sur un shaker...
Emmanuelle
Bonjour,
les protéines membranaires sont très difficiles à solubiliser. Peut être pourriez-vous tenter de le solubiliser dans de l'urée/thiourée si ce n'est pas incompatible avec votre western.
Cordialement
Il me semble que le CHAPS (détergent doux) est utilisé pour récupérer les protéines membranaires car il a l'avantage de solubiliser les membranes sans dénaturer les protéines (à la différence de détergent fort comme le SDS). Le triton 1% est un peu léger seul dans ton cas, il n'a pour effet que de déstabiliser la membrane plasmique provoquant sa rupture. Ta protéine a donc du rester dans des fragments membranaires, qui restent bloqués dans les puits sans centrifugation, ou qui partent dans le culot si tu centrifuges après lyse.
Greg
Dernière modification par LXR ; 17/08/2009 à 21h30.
salut
j'ai lysé mes cellules par un tampon de Karla au Bertin ,le tampon renferme dees antiprotéase ,PMSF,NAF,EAU,Napp.Je cherche aussi bien des protéines membranaire et du stress oxydative certaine sont cytosolique ,c'est bisard j'ai fais un dosage BCA j'ai des concentrations trés faible en protéine entre é 2 et 5 mg/ml mais c'est jouable pour déposer en faisant l'éléctrophorése à la fin du transfert j'ai révéler au ponceau il n'ya pas eu de transfert sur ma membrane et effectivement à la révalation d'une protéine j'ai rien vu au chémidoc alors que les marqueurs ont transférer
merci
j'attends votre réponse
