méthode de BRADFORD

[invitee053e8d7]

Salut à tous,

Je veux quantifier des protéines avec la méthode de BRADFORD, le problème c'est que je ne sais pas quelle est la plus faible et la plus forte quantité de protèines qu'elle peut détecter?
J'ai aussi un problème pour tracer ma courbe d'étallonnage, en effet, je n'arrive pas à trouver les mêmes valeurs de densité optique (DO) même si je refais les mesures le même jour!! Est ce que c'est normal???
Est ce que je dois obligatoirement trouver une DO de 0.4 nm pour 100 µg de BSA?
Merci d'avance à tous ceux qui peuvent m'aider.
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[Yoyo]

Salut

L'important n'est pas les concentrtion mini et max qu'on peut detecter, mais d'avoir une gamme dans la zone correspondante a l'echantillon que tu veux doser (il est inutile d'avoir une gamme dans les microgrammes, si tu veux doser des mg!).
Donc l'important est d'avoir une premiere idée de la concentration de ton extrait tu peux par exemple prendre la Do a 280 pour estimer ta quantité de prot.
Ensuite tu fais ta gamme, tu verras vite de toute maniere si tu es completement a l'ouest la couleur bleu doit apparaitre assez vite pour les concentrations les plus élevées. Tu attends 5-10mn et tu prends la DO. (a verifier mais il me semble que la gamme que nous faisons classiquement est 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30 micro grammes).

Normalement pour une concentration fixe de BSA tu dois obtenir a peu pret toujours la meme DO (le bradford n'est pas une technique precise, et 10 a 20% d'erreur n'est pas impossible).

YOyo

[dipediou]

tout depend aussi de la concentration du bradford que tu prepares, ou du kit utilisé. on ne peut pas te dire la DO que tu auras pour une concentration de BSA.
l'important c'est en effet de prendre des gammes proche et contenant la concentration de ta proteine.

autre chose, de quelle proteine souhaites tu connaitre la concentration?

je demande ca car j'avait eu un souci avec l'elastine kappa, cette saleté adhere au verre et à à peu pres tout ce dans quoi elle est contenue, donc des que tu le transvase (meme le pipetage si il est trop lent) va faire varier les concentrations

[invite77479dce]

Personnellement je n'ai pas non plus toujours la même DO pour la même quantité de BSA. Afin de minimiser les erreurs (sachant que comme le disait Yoyo la technique n'est pas précise) je fais une gamme à chaque mesure, et en triplicate. Ensuite je fais la moyenne de mes trois points (sauf en cas de mesure aberrante) et j'utilise cette moyenne pour tracer ma droite d'étallonage.
Je fais également la mesure de mes échantillons en triplicate.
Et si je pense que l'idéal est de préparer un volume de réactif suffisant pour tous tes tubes afin d'être le plus homogène possible.
J'espère avoir été d'une qualconque aide.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee053e8d7]

Bonsoir ;

Merci de m'avoir répondu. Mais en fait, je suis dans la zootechnie, et j'ai à determiner les concentrations en protèine d'ordre de microgramme (glandes hypopharyngiennes des abeilles) et je ne sais pas quelle concentration BSA à utiliser pour tracer ma courbe d'étallonnage? autrement dit comment je dois préparer la solution mère (quantité de BSA en poudre et la quantité d'eau distillée) ?
et que ma courbe doit contenir les concentrations BSA suivantes: 0 20 40 60 80 100 microgrammes

Merci d'avance.

[dipediou]

ca te fait une gamme très large...

a mon avis, ce que tu peux faire, c´est de preparer ta solution a 100microgrammes/ml, que tu diluera par la suite pour obtenir les autres concentrations.
pour etre plus sur de ton coup, tu fais comme te l´a suggeré JohnG, tu fait cette manip´ trois fois.
tu evitera ainsi les erreures que je fait souvent: foirer la solution initiale et donc les dilution suivantes.

[invitee053e8d7]

Bonsoir,
merci à tous, grace à vous j'ai réussi à tracer ma courbe d'étallonnage.J'ai encore un petit problème :comme j'ai 270 échantillons à analyser se sera facile et ça irra plus vite si je prépare à chaque fois une bonne quantité du réactif de bradford;ma question est :ce réactif se conserve pendant combien de temps?
Merci d'avance.

[Flyingbike]

C'est peut etre un peu tard, mais le bradford dilué au 5e se garde 2 semaines d'apres ma doc.