Conservation ADN

[botrytis]

Bonsoir les amis,

Ma question concerne la conservation d'extraits d'ADN suspendus dans du TE, est il possible de les conserver à 4°C (frigo) durant une période de 3 mois environs pour une utilisation ultérieure. si ce n'est pas le cas, comment procéder?

Merci d'avance

[Zellus]

Salut,

Il est plutôt conseillé de les conserver à -20°C.

[Moumoutte]

Bonjour,

oui entièrement d'accord -20°C est un minimum. Pour avoir essayer le 4°C c'est une très mauvaise idée

+

[botrytis]

mon dieu c'est foutu pour moi alors, je les ai conservé à 4°C depuis le mois de juin vous croyez que c'est foutu pour ma PCR??

[Enialix]

Bonjour,

cela m'ai deja arrivé d'oublier de l'ADN au frigo pendant un bon moment, et il était toujours utilisable. Si ce sont de bonnes quantitées, tente d'en déposer un peu sur gel. Si tu n'en a pas beaucoup, tu peu en prendre 1µl pour faire une transfo et 1µl pour tenter ta PCR, tu n'a rien à perdre.

[botrytis]

et si je refaisais une électrophorèse??

[Enialix]

Oui c'est ce que je voulais dire par "redéposer sur gel", je me suis mal exprimé.

Normalement quelques (une vingtaine) de nanogrammes d'ADN suffisent pour etre détectés par electrophorèse.

[botrytis]

Non Enialix, c'est moi qui ai mal compris, ma detresse et mon emportement ont eu raison de ma compréhension . merci pour tes conseils et ceux des autres bien sure. je refais et je vous tiens au courant. merci

[piwi]

Franchement, pour faire une bête PCR la conservation durant des mois à 4°C n'est pas un problème. Il m'est même arrivé de conserver un moment (des semaines) des échantillons sur ma paillasse et aucun souci.

[botrytis]

Salu Piwi,

Je dois avouer que tes interventions ont le chic de me rassurer pour de bon! (yoopi) quelle bonne nouvelle. par contre, cet aprés midi une autre question m'a interpelé, au moment de l'extraction (il y'a 3 mois) je n'ai pas procédé à la purification des échantillons au phénol. dois je paniquer?? surtout que mon matériel biologique de départ n'est plus à ma disposition

[Enialix]

Tu purifie ton ADN au phénol?
Tu parle bien d'ADN et non d'ARN?

Peut tu décrire ta procédure d'extraction d'ADN et l'endroit où tu t'es arrété?

[piwi]

Que les choses soient quand même bien claires. Quand je parle de conserver à 4°C des extraits d'ADN, c'est pour faire des PCR simples type génotypage (c'est à dire en général moins de 500 pb). Pour toute autre application, j'emets quand même des réserves. Les extraits dont je parle sont des extraits propres. Il existe plusieurs moyen d'extraire l'ADN, le plus classique étant le phénol/chloroforme (l'ARN ne s'extrait pas au phénol choloroforme mais plutôt au trizol/chloroforme/isopropanol). Assurez vous que ce que vous avez conservé était propre. Si c'est juste un digest de tissu il y a quand même des risques que les DNAses aient bien fait leur boulot.

Cordialement,
piwi

[botrytis]

Salut,

Oui c'est bien de l'ADN que j'ai extrait. j'ai utilisé un protocole à base de SDS 20%, par la suite j'ai utilisé le phénol-chloroforme-isoamyl dans une série de 4 centrifugations. ayant obtenu mes pelotes après avoir rejouté de l'éthanol, j'ai suspendu dans du TE et conservé à 4° comme je l'ai dis plus haut. je me suis arreter là (problème d'amorces non disponibles) vue qu'au final je compte faire une RAPD simple pour étudier la diversité inter et intra spécifique d'une collection de champignons

voilà

[Kucing]

Dans "TE", il Y a "E", pour "EDTA". En général, entre 0.2 et 1 mM, soit de quoi chélater entre 0.8 et 4mM des vilains cations divalents qui iraient activer une DNAse contaminante.
Si tu n'as pas manipé comme un cochon, ton ADN peut rester stable durant des années à 4°C. J'ai des tubes d'ADN génomique au frigo qui datent de 1991 (extraction SDS+Phénol, comme toi). ils ont servi l'année dernière pour faire un Southern blot (impossible s'il y a de la dégradation, même partielle), aucun problème.
Si en plus c'est pour de la PCR sur petits fragments, aucun souci, on arrive à amplifier des fragments vieux de plusieurs milliers d'années, et qui n'ont pas été conservés à 4°C dans le TE.

C'est costaud le DNA. En fait, c'est fait pour être costaud...


(PS: le moyen le plus sûr de conserver de l'ADN quand on pense qu'on ne va pas s'en servir avant un moment c'est sous forme précipitée, dans l'éthanol, à -20°C)

[botrytis]

merci Kucing. j'ai programmé ma PCR pour la semaine prochaine et je vous ferais part des résultats, ce sera le seul moyen de savoir si j'ai travaillé comme un cochon